亚叶酸钙中杂质检测方案(液相色谱仪)

仪器配置 应用实例 安捷伦科技 2D-LC/MS在线脱盐技术在药物杂质鉴定中的应用 The Mea sure of Confidence lytY tyn Agilent Technologies 前言： 在液相色谱方法的开发中，常会用到一些添加剂以提高色谱行为表现，但是这些添加剂经常无法兼容质谱检测，而在某些分析中，如杂质分析、代谢分析等，经常需要对某些新产生的杂质或代谢产物进行质谱鉴定，同时又不希望改变方法选择性以便通过保留时间对未知物进行定性。但是如果将原有方法中不能兼容质谱条件的添加剂改变的话，很可能造成选择性变化，从而无法定位欲分析的未知化合物的位置。 针对此类问题，安捷伦开发了一个基于阀切换的 2D-LC 方法，保证了在各个色谱峰的保留行为不发生变化的情况下(即原始色谱条件不变)，通过二维液相的方式将原始条件中的质谱不兼容流动相变为兼容流动相，从而实现用液质联用方法对未知杂质进行定量分析的目的。 目录 Heart-Cutting 2D-LC/MS 技术特点简介 4 应用实例 6 实例1：亚叶酸钙 6 实例2：5'-鸟嘌呤核苷三磷酸三钠盐 8 实例3：达托霉素 10 实例4：钆贝酸 12 实例5：色瑞替尼 14 实例6：倍他司汀 16 实例7：糠酸氟替卡松 18 实例8：阿莫西林 20 实例9：磷脂 21 实例10：胰岛素 23 实例11：蛋白质 25 结语 27 HEART-CUTTING 2D-LC/MS 技术特点简介 2D-LC 系统：中心切割法去除非挥发性缓冲液对质谱的影响 Heart-cutting 2D-LC (LC-LC)： 简单原理 第一维使用原始液相色谱流动相(如非挥发性流动相)及方法对目标样品进行分离。当目标组分出峰时，通过阀切换将目标组分准确切割并捕获后，第二维色谱泵将捕获的组分洗脱进行质谱检测。 特点 ·无需改变原始液相色谱分离方法，确保相同的分离选择性，便于准确选择目标组分，降低方法重新开发的繁复工作，简化色谱峰确认流程 LC， ·选择性切割目标组分进入捕获色谱柱 COOH COOH COOH 'COOH COCH COOH H COOH NH， H NH 'COOH H5 COOH NH HN COOH HN COOH NH )H HN OOH SH DH HN 'COOH CONH NH 'HNOC OH COOH OH H 第二维 二维泵 第一维 口 一维色谱柱 阀 一维泵 自动进样器 一维 DAD 二维色谱柱 二维 DAD ·一维色谱柱：常规LC色谱柱， ·二维色谱柱：色谱柱，小内径色谱柱 质谱 (推荐使用 QTOF) Agilent 杂质鉴定工作流程 实例1：亚叶酸钙 用户提供的液相色谱条件 ·色谱柱： Kromasil 100-5 C18， 4.6×250 mm，2.6 um ·流动相A： 0.1%四丁基氢氧化铵的磷酸氢二钠缓冲液 (pH=7.8) ·流动相B：甲醇 ·流速：1.0 mL/min·柱温：40℃·等度洗脱：A：B (78：22， v/v) x103 DAD1-DAD 1： Signal A：Sig=280.0，4.0 Ref=off 09_CF_impurity_2D_MSMS.d 杂质的分析 x103 [DAD1-DAD 1： Signal A：Sig=280.0，4.0 Ref=off 08_CF_2D_impurity.d 1.5 x103DDAD2-A：Sig=280.0，4.0 Ref=off 10_CF_blank_2D.d 样品和空白第二维的 UV 叠加色谱图。第二维在使用快梯度(梯度变化时间小于 3 min) 时，可能导致梯度溶剂峰与样品峰保留时间接近，但是根据峰高及面积的大小很容易定位到目标峰。 x106 -ESI Scan (17.205-17.272 min， 7 Scans) Frag=150.0V 08_CF_2D_impurity.d Subtract 14.5 15 15.5 16 16.5 17 17.5 18 Response Units vs. Acquisition Time (min) x106 -ESI Scan (17.205-17.272 min， 7 Scans) Frag=150.0V 08_CF_2D_impurity.d Subtract *332.2841 7 6- 5-436.2287 4- 3- 2- 165.0195 400.2649 235.575614 472.1581-L. 0- 杂质的质谱图及局部放大图 Best Y IDSourceYo NameY Formula Species ymiz yp ScoreVYRT DiffY Diff(ccm)Y口Score (MFG)YORYDPrecursor (A Find by MRM Y口Msss (MFG)YDBE YMFG C20H23N707 0-H0- 472.1581 9893 091 9893 473.1659 13 Spocics yo m/z 口 Score fiso. abund) Score(mass)VoScore (MFG.MSMS) 口 Score (MS) Vo Score (MFG)Vo Score fiso. spacing)7 Height7= lon Formula Y (M-H)- 472.1581 97.83 99.15 93.93 98.93 99.81 69731.5 C20 H22 N7 07 杂质分子式生成结果 安捷伦科技 2D-LC/MS 在线脱盐技术在药物杂质鉴定中的应用 实例2：5'-鸟嘌呤核苷三磷酸三钠盐 第一维色谱条件 第二维色谱条件 ·色谱柱： Luna C18(2) RP，250×4.6mm ·色谱柱： RP C18 ·流动相A： 0.1M TEAA 的水溶液(pH=6.0) ·流动相A： 10mM AA 的水溶液 ·流动相B： 0.1MTEAA 的水溶液/ACN (95：5，v/v) ·流动相B：甲醇 ·流速：0.8mL/min ·流速：0.3mL/min ·梯度洗脱 Response vs. Acquisition Time (min) 杂质的分析 x101DDAD1- DAD 1： Signal A：Sig=260.0，4.0 Ref=off 903_GTP_2D_MS.d x102DAD2 - DAD 2： Signal A：Sig=260.0，4.0 Ref=off 904_blank_2D_MS.d 样品和空白第二维的UV 叠加色谱图 x1055(C13H20 N5 O16 P3： -ESI Scan (30.188 min) Frag=360.0V 907_impurity1_2... x105 C13 H20 N5 O16 P3： -ESI Scan (30.188 min) Frag=360.0V 907_impurity1_2... 杂质的质谱图及局部放大图 Best VYID Source o Name Fcemula YaSpecies Va mz yo ScoreY RT DffV Ditf (spm)Score (MFG)口RT (Tot) Precursor (Acq)Find by MRM Product lon V DBE Y+ 0 MFG C13H20N5 016 P3 (M-H)- 594.00349583 19 95.83 8 Scecies7o m/zYo Score (iso.abund)vo Sccce (mass)Yo Score (MFG.MSMS) VScore (MS)YoScore (MFG)T= 1 Score fiso.spacing)7oHeightY lon Fotmula 仁 日 (M-H)- 594.0034 93.13 95.6 95.83 95.83 99.54 108564.3 C13H19N5 016 P3 杂质分子式生成结果 实例3：达托霉素 第一维色谱条件 第二维色谱条件 ·色谱柱： Phenomenex lb-sil C8， 4.6×250mm，5 pm ·色谱柱：RPC18 ·流动相A：磷酸二氢铵缓冲液 (pH=3.25) ·流动云A： 0.1%FA的水溶液 ·流动相B：乙腈 ·流动相B：乙腈 ·流速：1.5mL/min·等度洗脱： A：B (33：67，v/v) ·梯度洗脱 x102 DAD2-DAD 2： Signal A：Sig=214.0，4.0 Ref=360.0，100.0 22_impurity 4_2mg_MS_woFA.d 4 6 8 10 12 14 18 0：22 26283032343633840)442 44 46 485052254Response vs. Acquisition Time (min) DAD2 - DAD2： Signal A：Sig=214.0，4.0 Ref=360.0，100.0 22_impurity 4_2mg_MS_woFA.d Response vs. Acquisition Time (min) 杂质3的分析 x103 C72 H99 N17 O25：+ESI Scan (50.246-50.346 min， 10 Scans) Frag=200.0V 33_impurity... 杂质3的质谱图及局部放大图 M+HJ+ 1602.7074 945 99.98 98.4 98.4 99.92 2348 C72H100N17025 2256.4 405 100 1602.7071 -0.3 2348 100 42.1 16027074 -0.21 1944.7 34.9 86.2 1603.71 -0.2 1931.4 823 34.7 1603.7102 -0.14 944.2 16.9 41.8 1604.7128 0.2 948.4 40.4 17 1604.7126 0.1 332.3 6 14.7 1605.7154 0.5 321.4 13.7 5.8 1605.7149 0.31 93.7 1.7 42 1606.718 40 22 0.9 0.4 1606.678 24.87 杂质3分子式生成结果 实例4：钆贝酸 第一维色谱条件 第二维色谱条件 ·色谱柱： WondaSil C18，4.6×250 mm，3 um ·色谱柱： RPC18 ·流动相A：磷酸氢二钠/EDTA/四己基硫酸氢铵缓冲液 (pH=5.0) ·流动相A：1%FA的水溶液 ·流动相B：乙腈 ·流动相B：乙腈 ·流速：1.0mL/min ·梯度洗脱 ·等度洗脱： A：B(70：30，v/v) x103 DAD1-DAD 1： Signal A：Sig=210.0，4.0 Ref=off 06_STL_A_API_MS.d x1011DAD1-DAD 1： Signal A：Sig=210.0，4.0 Ref=off 06_STL_A_API_MS.d *22.1732 杂质2的分析 x1011DAD1-DAD 1： Signal A：Sig=210.0，4.0 Ref=off 06_A_Impurity1_MS_loop_pos.d xX105 +ESI Scan (18.386-18.402 min， 3 Scans) Frag=380.0V 06_A_Impurity1_MS_loop_pos.d Subtract 700 杂质2的质谱图及局部放大图 杂质2分子式生成结果 实例5：色瑞替尼 第一维色谱条件 第二维色谱条件 ·色谱柱： Kromasil 100-5 C18， 4.6×250 mm， 2.6 um ·色谱柱： RPC18 ·流动相A： 20 mM (NH)HPO4+10 mM 四丁基氢氧化铵缓冲液(pH=6.5) ·流动相A：水 ·流动相B：甲醇 ·流动相B：乙腈 ( x103 DAD1-DAD 1：Signal A：Sig=260.0，4.0 R e f=off 06_impurity_2D_MSMS.d ) x102 DAD1-DAD 1： Signal A：Sig=260.0，4.0 Ref=off 06_impurity _2D_MSMS.d 杂质的分析 x102DAD2-DAD 2： Signal A：Sig=260.0，4.0 Ref=off 04_impurity blank_2D_MSMS... 样品和空白第二维的 UV 叠加色谱图 Response Units vs. Acquisition Time (min) x10 5 C13 H14 CI N3 03 S：+ESI Scan (30.830-30.858 min， 2 Scans) Frag=360.0V 10_impueiry_2D_MSMS... x105 C13 H14 CI N3 03 S：+ESI Scan (30.830-30.858 min， 2 Scans) Frag=360.0V 10_impueiry_2D_MSMS... 杂质的质谱图及局部放大图 Best VVo lD Source Yo Name ya Formula7Species yo miz Vo Score Y RT DifYDit (ppm)VScore (MFG)RT (T9Precursor (Acq) Find by MRM Product lon Y DBE 7MFG C13H14CIN3 03S(M+H)· 3230519 9722 -007 9722 Species miz Vo Score Giso aburd)Vo Score(mass)7 Score (MFG，MSMS) 口 Score (MS) Score (MFG)V V Score fiso spacing)Heightlon Formula(M+H)+ 328.051990.83 100 97.22 9722 99.33 251879.6C13H15 C1N3 03S 杂质分子式生成结果 安捷伦科技 2D-LC/MS 在线脱盐技术在药物杂质鉴定中的应用 实例6：倍他司汀 第一维色谱条件 第二维色谱条件 ·色谱柱： SHISEIDO C18， 4.6×250mm，5pm·色谱普：RPC18·流动相A：十二烷基硫酸钠 (pH=4.7)·流动相A： 0.1%FA的水溶液·流动相B：乙腈·流动相B：乙腈·流速：1.0mL/min·柱温：40C·等度洗脱： A：B (60：40，v/v)·梯度洗脱 杂质的分析 x104(C14 H22 N2 05： +ESI Scan (9.496-9.522 min， 4Scans) Frag=120.0V xinyi-105-MS.d Counts vs. Mass-to-Charge (m/z) 杂质的质谱图 (M+H)+ 299.1603 714972 mz(Calc)Y Diff(mDa)Y Height 7 Height% Height Sum%Y+ m/z 日 Diff (ppm) 7 71653.8 842 100 299.1601 -02 714972 100 84 299.1603 -054 116994 13.7 163 300.1633 -0.6 11753.4 16.4 13.8 300.1638 -1.89 1631.7 1.9 2.3 301.1655 -0.4 1656.4 23 1.9 301.1659 -1.44 1626 02 02 302.168 14 240.5 0.3 03 302.1667 4.56 杂质分子式生成结果 实例7：糠酸氟替卡松 第一维色谱条件 第二维色谱条件 ·色谱柱： Agilent Zorbax SB-C18， 4.6x100 mm，3.5 pm ·色谱柱： RP C18 ·流动相A： 甲醇：水：磷酸=30：970：0.5 ·流动相A：水 ·流动相B：甲醇：乙酉：磷酸=30：970：0.5 ·流动相B：乙腈 ·流速：1.0mL/min ·梯度洗脱 6543 2 10 -1 局部放大色谱图杂质2AP|杂质1 19) 22021222324255：26272829 3031 323333435 3637338 3940Response vs. Acquisition Time (min) 杂质1的分析 50 x10 5 Cpd 1： C27 H29 F3 06 S：+FBF Spectrum (38.928 min) 1mg sample_postion2_UV with majorMSMSlm1MSMS_06.d Subtract539.17123 Counts vs. Mass-to-Charge(m/z) 杂质1的质谱图 Formula7 5coreVYo Msss 7心 Msss (D0) 7Msss (MFG)VoDi(ppm)7o Dif (sbsppm) Vo Dilf(mDa)7+RT VoRT Available (D C27 H29F306S 538.16401 9793 -059 0.59 38.785 -0.32 Species y lon Formulg口mz Yo HoightYoSoore (MFG)口 Soore (MS) Score (maso) Score (iso.abund) Score (so.spacing) (M+H0+ 53317143 148913.8 97.33 9962 2541 97.58 mz mz(Calc)e Ditt (opm)PDit(mDa)了eHeight YP Height (Cals)P Heigh Heght Sum%(Caic) 539.17149 53917097 -097 -05 148913.8 1440278 100 100 72.1 69.8 540.17401 540.17425 046 02 41341.9 44023 278 30.6 20 21.3 541.17236 54117255 036 02 12755.6 147158 86 102 62 7.1 542.1734 54217377 0.69 04 26222 30771 18 21 13 1.5 54317352 54317524 299 1S 675 5013 05 03 03 02 544.18272 54417706 -104 -57 1027 661 0.1 0 0 0 杂质1分子式生成结果 实例8：阿莫西林 用户提供的液相色谱条件 ·色谱柱： Zorbax Extend C18，4.6×150 mm，5um ·流动相A： 15 Mmol/L 磷酸二氢钾、5Mmol/L磷酸的水溶液 ·流动相B：乙腈 ·流速：1.0mL/min ·柱温：40℃ ·梯度洗脱 17.5 min 安捷伦科技 2D-LC/MS 在线脱盐技术在药物杂质鉴定中的应用 实例9：磷脂 用户提供的液相色谱条件 ·色谱柱：YMC-Pack-CN，6.0×150mm，5um ·流动相A： 0.1%三氟乙酸水溶液 ·流动相B：乙腈 ·流速：1.0mL/min ·柱温：40℃ ·等度洗脱 杂质1和7的同时分析(一次进样分析2个杂杂) 0M+H)+ 49633919805 9923 97.33 9845 9845 147349 C24H51NO7P 实例 10：胰岛素 第一维色谱条件 第二维色谱条件 ·色谱柱： Phenomenex Kinetex C18 100A，4.6×100mm，2.6 pm ·色谱柱： RP C18 ·流动相 A： 0.02 mol/L 磷酸二氢钾水溶液-三乙醇胺 (100：1，pH=2.3) ·流动相A： 1%FA的水溶液 ·流动相B：乙腈 ·流动相B：乙腈 ·梯度洗脱 ·流速：1.0mL/min ·梯度洗脱 x103 DAD1-DAD 1： Signal A：Sig=214.0，4.0 Ref=off 01_insulin_12 month_API_MS.d x103 DAD1-DAD 1： SignalA：Sig=214.0，4.0 Ref=off 04_insulin_12 month_IM_MS_trap.d 杂质1的分析 x102 DAD1-DAD 1： Signal A：Sig=214.0，4.0 Ref=off 04_insulin_12 month_IM_MS_trap.d x10 5 +ESI Scan (25.870-25.945 min， 10 Scans) Frag=200.0V 04_insulin_12 month_IM_MS_trap.d 2.55- Xk110 5 +ESI Scan (25.870-25.945 min， 10 Scans) Frag=200.0V 04_insulin_12 month_IM_MS_trap.d Deconvoluted5 Deconvolution result 2 1.5 0.5 0- 杂质1的质谱图及局部放大图 6250 Counts Vs. Mass-to-Charge (m/z) 实例11：蛋白质 第一维色谱条件 第二维色谱条件 ·色谱柱： Zorbax 300 SB C18/C8， 4.6×250 mm，5um ·色谱柱：RPC18 ·流动相A： 200mM硫酸钠， 40mM磷酸， NaOH调pH值(pH=3.6) ·流动相A： 1% FA的水溶液 ·流动相B：乙腈 ·流动相B：乙腈 ·流速：1.0mL/min ·梯度洗脱 ·梯度洗脱 安捷伦科技 2D-LC/MS 在线脱盐技术在药物杂质鉴定中的应用 Xx102 +ESI Scan (29.965-30.115 min， 19 Scans) Frag=380.0V6551-pos0001.d Subtract1.25 x10+ESIScan (29.923-3 ag=380.0V pos0001. 3CT 杂质质谱图的局部放大图 107 +ESI Scan (30.015-30.090 min， 10 Scans) Frag=380.0V 6551-pos0001.d Subtract Deconvoluted (Isotope Width=0.0) 5808.4 0.9 第二维色谱中二聚体副产物的 0.1 解卷积结果图 57985799 580005801 5802 5803358044 5805 5806580775808 58095810 5811lll 31258135814 5815558165817 5818 5819 结语 安捷伦科技2D-LC/MS 在线脱盐技术在药物杂质鉴定中具有很强的实用性，可有效的解决前端液相色谱分离必须使用非挥发盐流动相系统与后端采用质谱检测之间兼容性的矛盾；使用者无需进行 LC 方法转换，就可将质谱不兼容流动相体系的液相方法用于质谱检测；配合使用安捷伦杂质鉴定数据处理流程，可快速高效的完成特定杂质的鉴定工作。 目前该技术方法经验证，已成功的适用于无机盐(磷酸盐)流动相系统和有机离子对改性剂流动相系统(十二烷基磺酸钠、四丁基氢氧化铵等)。 更多信息： www.agilent.com.cn 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 安捷伦客户服务中心： 免费专线：800-820-3278 400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn 本资料中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 ◎安捷伦科技(中国)有限公司，2015 2015年3月，中国印刷 5991-5564CHCN Agilent Technologies 简单原理第一维使用原始液相色谱流动相（如非挥发性流动相）及方法对目标样品进行分离。当目标组分出峰时，通过阀切换将目标组分准确切割并捕获后，第二维色谱泵将捕获的组分洗脱进行质谱检测。特点? 无需改变原始液相色谱分离方法，确保相同的分离选择性，便于准确选择目标组分，降低方法重新开发的繁复工作，简化色谱峰确认流程? 选择性切割目标组分进入捕获色谱柱