河水和饮用水中农药残留检测方案(液相色谱仪)

安捷伦 1290 Infinity 液相色谱/6140单四极杆液质联用仪用于农药分析 应用简报 环境应用 作者 Rob SampleLittleover摘要Derby， DE23 3XH， UK 本应用简报描述了安捷伦1290 Infinity 液相色谱/6140单四极杆液质联用仪用于干净至中度污染水(如河水或饮用水)中的农药分析。开发了用于相对干净基质的水样分析的分离方法，样品的制备只需要用固相萃取 (SPE) 对其进行简单的富集和净化。本方法演示了如何利用分析方法来降低分析时间。 前言 在农药分析的文献中，有很多关于液相色谱与三重四极杆质谱联用的例子。虽然这些技术对“脏”的样品基质(如土壤或作物提取物)中的农药检测具有极高的灵敏度，但是对于干净的或中度污染的样品(如饮用水或河水)来说，单四极杆液质联用仪却是一种成本较低的分析技术。另外，将单四极杆质谱检测器加入到二极管阵列检测器系统通常是开始质谱检测方法的第一步。本应用简报建立了一种用于相对干净的水样分析的分离方法，样品经过固相萃取(SPE) 柱进行简单的浓缩和净化。方法还演示了是如何缩短分析时间，以及用于方法转换的简单技术。 实验 所有的分析都在安捷伦1290 Infinity 液相色谱上进行，系统包括二元泵、自动进样器、柱温箱和二极管阵列检测器，与其联用的是安捷伦6140单四极杆质谱，配置了大气压电喷雾离子离(API-ESI)。 安捷伦 ZORBAX快速高分离色谱(RRHD)，1.8 um 柱用于安捷伦 1290 Infinity 液相色谱系统。色谱柱的最大压力可达 1200 bar。对于初始的方法开发，选择安捷伦 ZORBAXStableBond C18 RRHD 100 mm， 2.1 mm，1.8 um 色谱柱。 样品 从 Dr. Ehrenstorfer GmbH (Pesticide Mix44， part no. 18000044 - Dr. EhrenstorferGmbH Bgm.-Schlosser-Str. 6 A， 86199Augsburg， Germany) 获得17种农药的乙青混标溶液，每个农药的浓度分别 10ng/pL。取一份混标，用水稀释10倍， 即1ng/pL(1ppm)，用于分离方法开发。 混合物包含三嗪、苯和氯乙酰苯胺类的除草剂。表1列出了所有的组分及其结构。所有的组分在酸性流动相条件下形成正离子。 结果与讨论 建立标准方法 选择安捷伦 ZORBAX StableBond C18 RRHD100mm， 2.1mm， 1.8 pm 柱用于分离方法的建立。优化分离条件，以使得17个组分能在 10 min 左右得到分离。在乙腈/水的流动相中加入甲酸(0.1%v/v)这样能使质谱检测中的电喷雾离子化效率更高，产生的正离子强度更高。 表1.农药测试混合物中的组分 17个组分分15个组分在 10 min 内得到分离，有两个化合物在 5.8 min 分钟时共流出(敌草隆和异丙隆)。使用质谱检测器的优点是，两共流出的组分可以根据质 荷比的差异得到分离。色谱柱梯度分离的最大压力是546 bar，远远低于液相色谱1200 bar的最大操作压力。表2显示了组分峰，表3总结了本文中使用的液质联用分析的条件。 安捷伦6140单四极杆液质联用仪可以同时采集四个通道的质谱信号 (MSD1到MSD2)。MSD1 可以设为全扫描模式，用来获得总离子流图中每个组分的质谱图(图1)，并确认每个组分的分子离子峰，以进行组分的鉴别和定量。所有组分都得到了高质量的质谱图，如图4a和4b所示为两个举例。 对于待测物的定量分析，采用选择离子扫描(SIM)以获得最高的选择性和比全扫描模式更高的灵敏度，因为这种模式下，质谱会在特定质荷比离子的采集循环上花更多的时间。选择离子扫描(SIM) 可以更灵活的采集一系列质量离散的离子。色谱上的共流出峰也可以用选择离子扫描(SIM)或用特定质荷比的提取离子流图(EIC) 来进行分离。在本文中， m/z 207和233代表异丙隆和敌草隆(图2)。图3为总离子图的局部放大图与提取离子流图的叠加图，可以更详细检查共流出组分。异丙隆和敌草隆的选择离子谱图见图4a和4b。敌草隆的质谱(图4a)显示了很高的分辨率和含两个氯原子的同位素分布，很容易与不含氯的异丙隆区分分(图4b)。 图1.农药混合物的色谱图 图2.农药混合物中 m/z 233 和207的提取离子流图 图3. 共流出组分异丙隆和敌草隆的全扫描总离子流图和提取离子流图的叠加图 峰 保留时间 m/z 序号 组分 (mins) [M+H1+ 脱乙基阿特拉津 1.791 ，， 甲氧隆 3.111 环嗪酮 3.323 253 4 西玛津 3.542 202 5 氰草津 3.878 241 甲基苯噻隆 4.990 222 绿麦隆 5.133 213 莠去津 5.336 绿谷隆 5.616 10* 敌草隆 5.847 11* 异丙隆 5.893 207 12 溴谷隆 6.203 259 13 吡唑草胺 6.777 278 14 另丁津 7.080 230 15 特丁津 7.773 230 16 利谷隆 7.936 249 17 异丙甲草胺 9.313 284 *敌草隆和异丙隆是共流出 100 m/z=233 Diuron Max： 94376 80. 60. A 40 20. 0 111 .t.l.ic 150 175 200 225 250 275 m/z 图4a.敌草隆的质谱图 100 8060-4020 m/z=207异丙隆 B Max： 1.25235e+006 11. ...1...1.1 280 m/z 图 4b. 异丙隆的质谱图 表2 组分峰 使用100mm 色谱柱建立快速分析方法 ZORBAX C18 RRHD 1.8 pm柱的固定相材料具有很高的分离效率，并支持更高的流速，这是由与小粒径相关的 Van Deemter剖面决定的。将流速提高一倍并调整梯度时间(为原来的一半)，以保持同样的梯度斜率，即在梯度期间通过柱的流动相体积，这样，10 min 的分析方法就会转换为5 min 的分析方法(图5)。 安捷伦 ZORBAX RRHD SB-C18 2.1 mm ×100 mm， 1.8 um 安捷伦 ZORBAX RRHD SB-C18 2.1 mm×50 mm， 1.8 pm 40°℃ 流动相A 0.1%甲酸的水溶液 流动相B 0.1%甲酸的乙腈溶液 色谱图： 图1 图5 图7 图8 柱长度 100 mm 100 mm 50 mm 50 mm 流速 0.5mL/min 1.0 mL/min 0.5 mL/min 1.0 mL/min 流动相梯度： 20%B 0.00 min 0.00 min 0.00 min 0.00 min 40%B 6.50 min 3.25 min 3.25 min 1.63 min 70%B 10.00 min 5.00 min 5.00 min 2.50 min 进样体积 10 pL 10 pL 5uL 5pL 进样针清洗 In Flush Port， 10 s， acetonitrile/water (50/50) 二极管阵列信号A 242 nm， bandwidth 4 nm. Reference Off. 二极管阵列信号B 226 nm， bandwidth4 nm. Reference Off 光谱仪狭缝宽度 4nm 安捷伦6140单四极杆质谱的条件 离子源 大气压电喷雾(API-ESI) 离子极性 正模式 毛细管电压 4000V 干燥气流速 12L/min 干燥气温度 350°C 雾化器压力 在0.5 mL/min 时为 30 psi； 在1.0 mL/min 时为 50 psi MSD Signal 1 Scan m/z 150-350 MSD Signal 2 SIM m/z 188， 202， 207， 216，222，229，249，278(分别延迟5ms) MSD Signal 3 SIM m/z 213， 215， 230， 233，241，253，259，284(分别延迟5ms) 碰撞电压 90V，所有信号 表3. 安捷伦1290 Infinity 液相色谱/紫外检测的条件 梯度斜率和流速之间的关系用下列方程表示 强溶剂的增加梯度斜率=-柱体积数 A%B·V，梯度斜率=F·t6 这里： 公%B 是梯度过程中较强流动相组成的范围 V是色谱柱的延迟体积或色谱柱中流动相的体积 F是流速 t是梯度的时间范围 这与梯度保留因子，即下列方程中的 k*相关，并显示了恒定的梯度斜率是如何保持相对峰间距的恒定的： S是每个溶质与化合物相关的因子 正如预期的那样，色谱图总体上是相同的，但保留时间是原来的一半。仔细观察发现了选择性的一些细微变化。在 2.9 min 时，敌草隆、异丙隆共流出峰显示了独特的峰肩，表示这两种化合物之间轻微的分离。峰6和峰7变得稍微重叠(与图1比较)。 由于梯度斜率保持恒定，可以得出结论，流速和压力可产生摩擦发热。在温度从30°℃至45°℃的条件下，进行分离数据的采集，以测试温度变化对分离的影响。正如预期的那样，总的趋势是，保留时间随着温度的增加而降低。也可以看出，不同的峰对之间的选择性也是温度敏感的。 图5. 农药混合物在 100 mm 色谱柱上，在5min 梯度、1 mL/min 的流速条件下的分离情况 选择性随着温度的增加而变化：甲基苯噻隆和绿麦隆(峰6和7)的选择性降低；绿麦隆和阿特拉津(峰7和8)的选择性增加；敌草隆和异丙隆(峰10和11)的选择性增加；特丁津和利谷隆(峰15和16)的选择性下降。 改变流速和压力观察到的选择性变化可能是通过摩擦加热效果来显示的。这可由从1°℃到2℃的经验比较来预计。在这种情况下，可以将柱温箱的温度降低1℃至2℃来抵消影响，详细内容将另有报告[1]. 如果在色谱柱内产生径向温度梯度，摩擦产生的热会导致峰展宽。系统使用的柱温箱类型决定所受到的影响。 1290 Infinity 液相色谱仪柱温箱的设计避免了这个问题。因此，观察到的峰宽没有其它的扩展。 温度增加，降低了流动相的粘度，导致压力读数的差异(如30℃时，压力读数为1110 Bar； 而在45℃时，压力读数为920 bar)。这种现象可以为压力和流速的增加创造更多的空间(图6)。 使用50mm 色谱柱建立快速分析方法 安捷伦 ZORBAX C18 RRHD 1.8 pm 色谱柱能够提供高效率的分离。100 mm 色谱柱分离数据表明，同样填料的50mm 色谱柱也足以达到要求。从100 mm 色谱柱到50 mm 色谱柱的方法转换与我们上面讨论的方法相同。因为固定相是相同的，所以只要梯度一样，分离性能也应该是一样的。流速保持不变，色谱柱的长度减半，所以组分峰的保留时间也减半。为了保持梯度斜率不变，时间表里的时间步长(t )应该除以2，因为柱体积(V)也只有一半。100 mm 长的色谱柱的 10 min 分析在50mm长的色谱柱分析时间降低为 5 min。 得到的色谱图如图7所示。它与图1中100 mm 色谱柱的色谱图相似。可以预料，与100mm 色谱柱相比，等梯度条件下通过理论塔板数(N) 测量的50 mm 色谱柱的分离效率将减半。分离度的影响因子大约是1.5，从表4的实验结果看到，峰宽、分离度和峰容量因为这个因子而降低。全扫描色谱图中的组分峰分离的最关键的分辨率是峰14和15之间，其分离度是1.2。然而，选择离子扫描 (SIM) 将这两个峰完全分离。50 mm 色谱柱的最大压力是 290 bar，而 100 mm 色谱柱的最大压力是 550 bar.虽然常规液相色谱(400 bar) 也可以满足290 bar的条件，如安捷伦的1200液相色谱系统，但是系统延迟体积的增加使得梯度更长。另外，较大流动池导致的峰扩展也会降低分离度。 图6.温度对分离的影响：30°C下的色谱图(压力， AP=1110 bar)、35°℃下的色谱图(压力， AP=1045 bar)、40°℃下的色谱图(压力， AP=970 bar)、45℃下的色色图(压力， AP=920 bar) 图7.农药混合物在 50 mm 色谱柱上， 在 5 min 梯度、0.5 mL/min 流速条件下的分离情况 对于 100mm 的色谱柱，同样可以通过增加流速。降低梯度时间的技术，来维持梯度斜率。图8显示的色谱图为，在50mm色谱柱上，在2.5 min 梯度以及1 mL/min的流速条件下，操作压力为 550 bar。全扫描的总离子流图显示，分辨率有所降低，但是选择离子扫描(SIM) 仍然具有很好白分分率。安捷伦 1290 Infinity 液相色谱的最大操作压力为 1200 bar， 这使得流速提高了两倍。电喷雾离子源的最大流速是1 mL/min， 因此，需要分流器来保持很好的质谱检测效率。 100 mm 柱， 10 min 梯度， 0.5 ml/min 50 mm 柱， 5 min 梯度， 0.5 ml/min 峰 保留时间 峰宽 分辨率 峰容量 保留时间 峰宽 分辨率 峰容量 1.789 0.043 173 0.902 0.030 2 3.110 0.046 18.0 1.534 0.033 12.0 3 3.321 0.046 2.7 1.627 0.033 1.7 4 3.541 0.053 2.6 1.768 0.037 2.4 99 5 3.877 0.050 3.8 1.926 0.035 2.6 4.989 0.053 12.7 2.462 0.036 9.0 7 5.132 0.051 1.6 2.538 0.035 1.3 5.333 0.054 2.2 2.658 0.038 1.9 99 5.615 0.050 3.0 2.796 0.040 2.1 92 10 5.890 0.064 2.7 2.906 0.044 1.6 85 11 6.201 0.049 3.0 3.086 0.037 2.6 101 12 6.777 0.065 5.7 3.350 0.043 3.9 86 13 7.077 0.062 2.8 3.518 0.041 2.3 91 14 7.772 0.055 7.0 3.865 0.037 5.2 15 7.936 0.051 1.8 3.939 0.034 1.2 16 9.313 0.047 16.3 159 4.624 0.033 11.8 表4. 100 mm 和50 mm 色谱柱上各组分峰参数的比较 图8. 农药混合物在 50 mm 色谱柱上， 在 2.5 min 梯度与1 ml/min 的流速条件下的分离情况 本应用简报介绍了一种用于三嗪、苯和氯乙酰苯胺类除草剂的快速分析方法，方法采用了配备 1290 Infinity 液相色谱以及安捷伦6140单四极杆液质联用仪的亚 2 pm色谱柱，整个分析时间小于10min。本文着重介绍了包括摩擦生热效应在内的超高压液相色谱方法开发的几个方面。通用的分析方法转换技术显示，利用质谱检测方法进行的分离，其速度得到了大大提高，并且能够在 2.5 min 内完成分离。 ( 参考文献 ) ( 1. Pat Sandra， "Increasing productivityin the analysis of impurities in metoclopramide hydrochloride formulations using the Agilent 1290 InfinityLC s ystem"， Agilent Application Note 5990-3981EN，2009. ) www.agilent.com/chem/1290 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 本资料中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 @安捷伦科技(中国)有限公司，2010 ( 2010年5月1日，中国印刷 ) 5990-5794CHCN Agilent Technologies Agilent Technologies 在农药分析的文献中，有很多关于液相色谱与三重四极杆质谱联用的例子。虽然这些技术对“脏”的样品基质（如土壤或作物提取物）中的农药检测具有极高的灵敏度，但是对于干净的或中度污染的样品（如饮用水或河水）来说，单四极杆液质联用仪却是一种成本较低的分析技术。另外，将单四极杆质谱检测器加入到二极管阵列检测器系统通常是开始质谱检测方法的第一步。本应用简报建立了一种用于相对干净的水样分析的分离方法，样品经过固相萃取（SPE）柱进行简单的浓缩和净化。方法还演示了是如何缩短分析时间，以及用于方法转换的简单技术。本应用简报介绍了一种用于三嗪、苯和氯乙酰苯胺类除草剂的快速分析方法，方法采用了配备1290 Infinity 液相色谱以及安捷伦6140 单四极杆液质联用仪的亚2 μm色谱柱，整个分析时间小于10 min。本文着重介绍了包括摩擦生热效应在内的超高压液相色谱方法开发的几个方面。通用的分析方法转换技术显示，利用质谱检测方法进行的分离，其速度得到了大大提高，并且能够在2.5 min 内完成分离。