裙带菜配子体中携带bar基因的质粒载体检测方案(基因导入仪)

研究报告 REPORTS 导入 bar 基因获得裙带菜草丁膦抗性配子体 任宝永1.2，姜 鹏'，崔玉琳12，姜进举23，秦 松 (1.中国科学院海洋研究所，山东青岛266071；2.中国科学院研究生院，北京100049；3.中国科学院烟台海岸带研究所，山东烟台264003) 摘要：裙带菜(Undaria pinnatifida)配子体经2.5L气升式光生物反应器快速营养增殖，通过基因枪法将携带草丁膦抗性基因(bar)的载体转入扩增后的配子体，经草丁膦筛选，获得抗性克隆。提取抗性克隆配子体基因组总DNA， 经 PCR 和 PCR Southern检测，结示显示60%的抗性克隆可检出 bar基因，表明bar 基因是裙带菜配子体基因工程有效的筛选标记。 关键词：裙带菜(Undaria pinnatifida)配子体；基因工程；草丁膦抗性基因 中图分类号： S968.42 文献标识码：A 文章编号：1000-3096(2012)01-0006-04 裙带菜(Undaria pinnatifida)在中国已形成规模化栽培，具有重要的经济价值。大型海藻的基因工程研究开始于20世纪90年代，建立了以海带为材料的稳定表达系统1-21。裙带菜与海带同属海带目大型褐藻，通过借鉴海带的经验，于道展等3、秦松等4分别实现了 lacZ 报告基因在裙带菜孢子体中的瞬间表达和稳定表达，证明基因枪法是适合裙带菜的有效导入方法，通过在配子体阶段进行遗传操作，在孢子体阶段进行表达是可行的技术路线，但尚未发展有效的选择标记对转化子进行筛选。张亦陈等5]、于道展等6开展了裙带菜配子体对不同筛选试剂的敏感性试验，发现对草丁膦非常敏感，提示草丁膦可作为裙带菜配子体遗传转化的筛选试剂。鉴于褐藻配子体不同品系的发育和生长速度存在较大差异，作者首先利用2.5L生物反应器验证试验品系的快速营养增殖能力，之后应用基因枪法将草丁膦抗性基因(bar)导入裙带菜配子体，经草丁膦筛选和PCR及 PCR Southern检测，综合分析 bar 基因作为裙带菜配子体基因工程选择标记的可行性。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 裙带菜配子体的培养 裙带菜配子体品系(U2)由本实验室保存，采用 PES 培养液静止培养，培养温度为22℃，光暗周期为14 h/10 h，光照强度为17001x。 1.1.2 菌株及质粒载体 宿主菌为 Escherichia coli TOP10菌株，转化所用质粒载体为 p35bar40tac，该载体携带 bar基因，上游为 CaMV35S启动子，下游为 nos 终止子。菌株与载体均由本实验室保存。 1.1.3 仪器、耗材与试剂 2.5L气升式光生物反应器由中国科学院过程与工程研究所试制，J基因枪转化所用 GJ-1000)高压气体基因枪、DNAA载片、阻挡网、可裂膜(7MP)和金粉均为宁波新芝公司产品，， Southern 杂交所用杂交膜、地高辛DNA标记和检测试剂盒购自Roche公司，质粒小抽试剂盒购自天根公司，植物基因组提取试剂盒购自百泰克公司。 1.2 方法 1.2.1 2.5L气升式光生物反应器中增殖配子体 1.2.1.1 培养条件 裙带菜配子体在2.5L反应器中采用PES培养液营养增殖，培养温度为22℃，光照强度为2200 lx，通气量为0.6 L/min， 光暗周期为14 h/10 h。 1.2.1.2 生长指标的测定 共测量3个生长指标： pH 值、DO 和叶绿素a. ( 收稿日期：2011-04-24；修回日期：2011-06-23 ) ( 基金项目：江苏省科技计划项目(BE2008341)；国家863计划项目 (2009AA10Z106)；山东省博士基金项目(2010BSB02009)；山东东方海 洋科技股份有限公司科研开放基金项目(200810) ) ( 作者简介：任宝永(1985-)，男， 硕 士研究生，海洋 药 物专业， E-mail：baoyong2008@yahoo.cn；秦松，通信作者，研究员，博士，从事海洋生 物技术研究，E-ma i l： sq i n@ms.qdio.ac.cn ) 前两者通过pH 电极和溶氧电极检测。由于裙带菜配子体在培养过程中形成多细胞丝状体，不能通过测量藻体的吸光值来直接测定藻体的生长状况，作者借鉴采用 Porra 测定叶绿素的方法来间接测定其生长速度I8]。 1.2.2 转化质粒载体的制备 采用天根公司的质粒小抽试剂盒提取高质量的质粒载体DNA。 1.2.3 基因枪转化 1.2.3.1 藻体转化前处理 利用自然沉淀的方式收集2.5L气升式生物反应器中培养的配子体细胞，使用载玻片研磨丝状配子体至形成5~10个细胞的藻段，避光恢复培养 24h。 1.2.3.2 基因枪转化 微粒子弹的制备及基因枪的轰击按照 Jiang 的方法，轰击压力7MP， 真空度为-0.085 MP， 轰击距离为6cm， 共转化两组样品，每组样品平行轰击2次。 1.2.4 裙带菜配子体的筛选和扩增 转化后的配子体细胞避光恢复培养24 h，之后见光恢复培养7 d，培养条件为：温度为22℃，光周期14 h/10 h，光照强度为1700 1x， 使用 PES 培养液。7d后加入草丁膦筛选，草丁膦质量浓度为50 mg/L，持续筛选3周，每周更换1次培养液。3周后更换含30 mg/L 的草丁养培养液，1周后去除草丁膦恢复培养，60d后取抗性克隆分别单独培养，用于 PCR 检测。 1.2.5 转基因裙带菜配子体的分子检测 利用百泰克植物基因组提取试剂盒提取抗性克隆的基因组总DNA， 设计扩增引物见表1和图1.以提取的两个转化组的基因组 DNA 为模板，用 p1和p3引物 PCR 扩增检测。从两个转化组中各挑选一个 表1 PCR 引物序列 Tab.1 Oligonucleotide sequences of primers 图1 PCR 引物与 Southern 杂交探示示意图 Fig.1 Primers design for bar gene and the Southern blot 阳性PCR 产物，以其为模板，利用 p2和p3引物二次 PCR扩增，将此次得到的 PCR 片段进行 Southern杂交。以 p2 和p3为引物，从质粒上扩增 bar 基因片段，该片段纯化后以随机引物法地高辛标记制成探针。Southern 杂交检测方法参照 Roche 公司的地高辛 DNA 标记和检测试剂盒使用说明进行。 PCR程序为：94℃预变性5 min， 94℃变性45 sec，54℃退火 35 sec(p1/p3)或57℃退火 35 sec(p2/p3)， 72℃延伸1 min， 循环35 次，72℃延伸10 min。 2 结果 2.1 裙带菜配子体在2.5L气升式光生物反应器中的培养 将配子体在2.5L气升式光生物反应器中进行培养，每天定时测量 pH、溶氧(DO)和叶绿素 a含量，培养过程大致可以分为两个阶段：第一阶段(1~5 d)，培养基中的溶氧、pH值和叶绿素a含量变化不大，第二阶段(6~10d)，溶氧升高， pH 值也随之略有升高，同时叶绿素 a 含量逐渐增加。在整个培养周期中，配子体大约扩增了3倍，说明该转基因所用品系配子体可以实现快速营养增殖(图2)。 图2 裙带菜配子体在2.5L光生物反应器中的生长曲线及溶氧和 pH变化曲线 Fig. 2 The growth， variation of DO and variation of pHcurve of U. pinnatifidagametophytes inln2.5Lphotobioreactor 2.2 草丁膦筛选 基因枪转化后，配子体在黑暗中恢复培养24 h，之后在 PES 培养液中静置培养。1周后转入 50 mg/L草丁膦溶液中筛选。发现配子体在草丁膦的作用下逐渐由褐色转为绿色，筛选1周之后大部分配子体白化死亡，每周更换筛选培养液。3周后，将配子体转入低剂量 30 mg/L 草丁膦培养液中恢复培养1周，之后将配子体转入正常 PES培养基中恢复生长，约2 个月后，第一转化组有18个抗性克隆出现，第二个转化组有15个抗性克隆出现，将抗性克隆分离并单独培养增殖。 2.3 PCR及 PCR Southern 检测 从第一和第二转化组中分别随机取12和10个抗性克隆，提取其基因组总 DNA 并做PCR检测，利用p1和p3引物扩增载体中间818 bp 的片段。两个 转化组均获得抗性克隆，第一转化组有6个阳性克隆(图3)，第二转化组有7个阳性克隆(图4)，统计数据如表2所示。从第一和第二转化组中各取一个阳性PCR 产物进行二次 PCR， 得到424 bp的片段，该产物进行 Southern 杂交检测，结果显示两转化组PCR Southern 杂交均有阳性信号(图5)，表明两组抗性克隆配子体已成功转化 bar 基因。 图3 p1和p3引物PCR扩增检测第第-转化组 Fig. 3 PCR analysis of Group 1 transformed U. pinnatifida gametophytes genomic DNA with p1/p3 primers 1-12：转化的配子体抗性克隆 DNA； 13.PCR 空白对照；14.未转化的配子体 DNA； 15.质粒； M.DL2000 DNA marker1-12. transformed U. pinnatifida gametophytes clones； 13： blank control； 14. untransformed U. pinnatifida gametophytes； 15. plasmid； M. DL2000 DNA marker 图4 p1 和p3引物 PCR 扩增检测第二转化组 Fig. 4 PCR analysis of Group 2 transformed U. pinnatifida gametophytes genomic DNA with p1/ p3 primers 1-10.转化的配子体子性克隆 DNA；11. 未转化的配子体 DNA； 12. PCR 空白对照；13.质粒； M.DL2000 DNA marker 1-10. transformed U. pinnatifida gametophytes clones； 11.untransformed U. pinnatifida gametophytes； 12. blank control； 13. plasmid； M.DL2000 DNA marker 表2 阳性克隆配子体统计 Tab.2 Statistics of positive clones 组别 抗性克隆数量(个) PCR检测数量(个) 阳性克隆数量(个) 阳性克隆率(%) 平均阳性克隆率(%) 第一组 18 12 6 50 60 第二组 15 10 7 70 图5 PCR-Sourthern Blotting 检测 bar 基因(p2/p3 引物) Fig.5 PCR-Sourthern Blotting analysis of bar gene (p2/p3primer) M.DL2000 DNA marker； 1.PCR 空白对照；2.未转化的配子体；3.第一转化组的配子体；4.第二转化组的配子体；5.质粒 M. DL2000 DNA marker； 1. blank control；2. untransformed U. pin-natifida gametophytes； 3.Group 1 transformed U. pinnatifida gameto-phytes； 4.Group 2 transformed U. pinnatifida gametophytes； 5. plasmid 3 讨论 作者以裙带菜配子体为材料，利用基因枪法导 入含有 bar 基因的质粒载体，经草丁膦筛选，两个转化组分别获得18个和15个抗性克隆，PCR检测结果显示，平均阳性克隆率为60%，结果显示 bar 基因能够赋予转化子草丁膦抗性并在筛选压力下存活。本文首次证明 bar 基因是裙带菜基因工程有效的筛选标记。 筛选标记基因是藻类基因工程的重要载体元件，用于筛选成功转化的细胞。草丁膦抗性基因(bar)是植物基因工程常用的筛选标记基因，其原理是 bar基因编码 PPT 乙酰辅酶A转移酶，能催化乙酰辅酶A与草丁膦的游离氨基结合，使其失活19-10]。在抗性克隆中有40%的配子体为假阳性，分析其中的原因，主要与配子体的生长特点有关，配子体是多细胞段藻体，在生长过程中会出现配子体黏附一起生长现象，有些会形成小的细胞团。当加草丁膦筛选后，处于细胞团内部的配子体接触的药物浓度剂量较低， 出现不完全致死效应，待恢复生长时，这些配子体会逐渐恢复，出现假阳性克隆，以后的研究中可以通过每天定时摇动培筛养液来加以克服。 ( 参考文献： ) ( [1] ] Jiang P， Q in S. Expression of th e lacZ reporter gene insporophytes of t he ； seaweedLaminaria japonica (Phaeophyceae) b y g a metophyte-targeted tr a nsforma-tion[J]. Plant Cell Reports， 2003， 21(12)：1211-1216. ) ( [2] Q in S ， J iang P， Tseng C K . Transforming kelp into amarine bioreactor[J]. 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EMBO J， 1987， 6(9) ： 2519-2523. ) Transformationof phosphiothriciresistancegene(bar)) inUndaria pinnatifida gametophytes REN Bao-yong1.2， JIANG Peng1， CUl Yu-lin1.2， JIANG Jin-ju23， QIN Song (1. Institute of Oceanology， Chinese Academy of Sciences， Qingdao 266071， China； 2. Graduate University of ChineseAcademy of Sciences，Beijing 100049， China； 3. Yantai Institute of Coastal Zone Research， Chinese Academy of Sci-ences， Yantai 264003，China) Received： Apr.， 24， 2011 Key words： Undaria pinnatifida gametophyte； genetic engineering； phosphiothrici resistance gene Abstract： Undaria pinnatifida gametophytes were cultured in a 2.5 L airlift photobioreactor， and were transformedwith phosphiothrici resistance gene (bar) by particle bombardment. After phosphiothrici screening， resistancecolonies appeared. PCR and PCR Southern blotting results showed that bar gene had integrated into the genome of60% of the U. pinnatifida gametophytes and could be a suitable selective marker for U. pinnatifida gametophytegenetic engineering. ( (本文编辑：梁德海) ) 海洋科学//第/第期?China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http：//www.cnki.net      裙带菜(Undaria pinnatifida)配子体经2.5 L气升式光生物反应器快速营养增殖，通过基因枪法将携带草丁膦抗性基因(bar)的载体转入扩增后的配子体，经草丁膦筛选，获得抗性克隆。提取抗性克隆配子体基因组总DNA，经PCR和PCR Southern检测，结果显示60%抗性克隆可检出bar基因，表明bar基因是裙带菜配子体基因工程有效的筛选标记。