菠菜中阴离子型极性农药检测方案(液质联用仪)

「应用纪要]WatersTHE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 「应用纪要 Benjamin Wuyts1、Euan Ross?和Simon Hird， 应用优势 适用于测定菠菜中多种极性农药的高专属性靶向分析方法，可同时满足官方质控要求和食品生产商的检测要求，该方法具有如下优势： 改善色谱保留时间、峰形和选择性(相较于早期方法)。 灵敏度足以测定粗提取物中ppb水平的残留 沃特世解决方案 Torus"DEA 色谱柱ACQUITY""UPLC""I-Class 系统 XevoTQ-XS 质谱仪 MassLynx"MS软件 TargetLynxXS 应用管理软件 关键词 UPLC-MS/MS， 阴离子型极性农药，草甘膦，QuPPe方法 简介 对食品或饲料生产中用作原料的农作物施用农药而导致的农药残留问题是威胁公众健康的一大风险因素。各个国家/地区都为此建立了全面的法规体系，针对活性成分的审批、农药的使用，以及食品中农药的最大允许残留量给出了明确标准。残留物是通过评估活性成分确定的，可能包括相关代谢物及其它转化产物。食品监管检测项目会检测产品是否符合农药最大残留量(MRL)或可接受标准、评估膳食摄入量，还会检查产品是否使用了未经批准的农药。食品行业本身也会出于责任、品牌保护或产品出厂检验等目的，对原料和成品进行检测。有些极性农药极为常用，因此需要稳定的方法来监测它们在食品中的残留，以确保残留量符合当地法规规定的最大允许限值要求。对于已获批的用途，其MRL通常比较高(以大麦中的草甘膦残留为例，欧盟规定的MRL为20 mg/kg，美国规定的MRL为30 mg/kg²)。而对于未规定MRL的用途，默认采用“检测限或检测限左右”作为MRL。尽管上述法规限值高于大部分其它农药的限定值0.01 mg/kg，但在过去几年间，新规定的限值已经降至0.3~0.1 mg/kg。为了促进贸易，一些国家/地区针对某些极性农药规定了临时MRL或国家/地区干预限值。 尽管现在已经有不少多残留LC-MS/MS方法可用于分析食品中的农药残留，但仍有一些农药不适合采用这些通用方法进行分析，原因是这些农药的极性和/或离子强度太高，导致其难以成功被萃取出来，并且/或者在常用的C，色谱柱中保留性能较差。过去，人们采用一系列具有专属选择性的单残留方法单独分析这些化合物，分析成本极高，因此监管计划往往会将这些分析物排除在外。QuPPe(极性农药快速提取)方法可可同时提取多种强极性农药及其代谢物。QuPPe方法通常需要配合高灵敏度的LC-MS/MS仪器，目的是解决粗提取物(未净化)中显著的基质效应问题。 尽管QuPPe方法可与多种色谱技术配合使用(包括采用离子对试剂或衍生化步骤的反相(RP)色谱、多孔石墨化碳黑(PGC)色谱、离子色谱(IC)、亲水作用色谱(HILIC)和“混合模式”色谱)，但有研究表明这些方法都有一定局限性。目前已有报道的问题涉及以下方面：分析范围(需要使用多种不同的单残留分析方法)、需要专用设备(例如IC)、保留性能/选择性不理想、保留时间漂移、基质效应导致明显的离子抑制作用，以及操作背压限制了可用流速，还使得色谱柱容易发生堵塞。 之前我们研究过上述方法检测食品中阴离子型极性农药的优缺点4.5。在本应用纪要中，我们验证了一种农药检测方法，该方法基于QuPPE， 并创新性地将Waters° Torus DEA色谱柱(部件号186007616)用作UPLC色谱柱，能够经济有效地检测菠菜中的多种极性农药及其代谢物。 样品制备和萃取 有机菠菜样品购自零售店。菠菜冷冻存储，取出之后在搅拌器中匀质化。采用EURL极性农药快速提取(QuPPe)方法萃取测试样品。萃取方法法详细步骤如图1所示. 根据SANTE指南评估方法性能。为了评估方法的准确度，按0.01和0.05 mg/kg对多份测试样品进行加标(n=5)。制备浓度范围在0.0075至0.200 mg/kg(7.5至200 ppb)的基质匹配标准品溶液，以测定加标样品中阴离子型农药和代谢物的浓度(采用分段校准)。 UPLC条件 使用前需要对LC系统和色谱柱进行清洗和活化，以去除金属离子，因为金属离子能够与极性农药相互作用，进而导致峰形变差。详情请参阅入门指南。 UPLC系统： ACQUITY UPLC I-Class， 配有样品管理器-FL(配备50pL定量环) 色谱柱： Torus DEA 130 A， 1.7 pum， 2.1 mmx100 mm 流动相A： 50mM甲酸铵+0.9%甲酸 流动相B： 乙腈+0.9%甲酸 流速： 0.5 mL/min 进样体积： 10 uL 进样模式： 针溢出部分环定量(PLNO) 弱清洗溶剂： 90：10 乙腈：水 强清洗溶剂： 10：90乙腈：水 柱温： 50°℃ 样品温度： 10°℃ 运行时间： 16 min 梯度*： 时间 (min) %A %B 曲线 0.00 10 4.50 2 6.50 6 16.0 10 1 *进样结束与梯度开始之间有320pL延迟。 MS条件 数据采集和处理 MS系统： Xevo TQ-XS 电离模式： ESI- 毛细管电压： 2.5kV 离子计数阈值： 40 脱溶剂气温度： 600℃ 使用MassLynx MS软件(v.4.2)采集数据， 并用TargetLynx XS应用管理软件进行处理。单独进样所有分析物溶液，然后使用IntelliStart"软件评估所得数据，据此选出MRM通道并优化关键参数，从而自动生成采集和处理方法。分析乙烯利时采用软电离模式。利用Autodwell功能自动设置最佳驻留时间。 脱溶剂气流速： 1000 L/h 离子源温度： 150C 锥孔气流速： 300 L/h 碰撞气流速： 0.14 mL/min 喷雾器气压： 7 Bar 表1.阴离子型极性农药的MRM参数(粗体为定量通道)。 化合物 保留时间 MRM 锥孔电压 CE 驻留时间 (min) (eV) 1.72 99>83 20 18 0.085 高氯酸盐 99>67 20 45 0.085 1.88 110>63 15 15 0.085 氨甲基膦酸(AMPA) 110>79 15 15 0.085 2.33 151>133 15 12 0.031 3-甲基磷酸亚基丙酸(MPPA) 151>107 15 16 0.031 2.41 180>85 15 25 0.025 草铵膦 180>95 15 15 0.025 2.73 83>67 15 14 0.037 氯酸盐 83>51 15 15 0.037 2.76 125>79 15 14 0.023 2-羟乙基膦酸(HEPA) 125>95 15 12 0.023 2.83 109>81 15 10 0.019 三乙膦酸铝 109>63 15 16 0.019 2.84 143>107 15 8 0.032 乙烯利 143>79 15 13 0.032 2.90 222>136 20 20 0.037 N-乙酰草铵膦(NAG) 222>69 20 14 0.037 2.99 168>63 15 15 0.105 草甘膦 168>150 15 10 0.105 3.35 81>79 15 10 0.217 膦酸 81>63 15 15 0.217 结果与讨论 在实验室进行方法验证时，应选择具有代表性的样品作为实验对象，以证明某方法用于其目标用途的适用性。依据SANTE指南的要求，我们选择菠菜作为高含水量样品的代表进行测试，用于评估方法的灵敏度、平均回收率(正确性或偏差的量度)、精密度(按重复性RSDr计)和方法的定量限(LOQ)。文件将LOQ定义为：在准确性和精密度满足方法性能标准的前提下，可以向样品中加标的最低分析物浓度。 灵敏度 基质匹配标准品的分析结果表明，该方法具有出色的灵敏度和选择性。图2展示了浓度为0.01 mg/kg的各种分析物的响应值。图3进一步展示了同分异构体化合物的色谱分离结果。AMPA和三乙膦酸会生成已被证实属于同分异构体的离子，膦酸也可通过源内碎裂形成三乙膦酸，因此必须让这些物质实现色谱分离。 % -min -min m/z 110>63 m/z 109>81 AMPA 三乙膦酸铝 % -min -min m/z 151>133 m/z 143>107 MPPA 乙烯利 % %nmin -min m/z 180>85 m/z 222>136 草铵膦 NAG % min -min 氯酸盐 m/z 83>67 草甘膦 m/z 168>63 % % nmin hmmin2.00 2.50 3.00 2.00 2.50 3.00 图2.阴离子型极性农药的典型色谱图，基质匹配标准曲线分析菠菜样品，加标浓度为0.01 mg/kg(10 ppb)。 AMPA m/z 110>63 - min △= 0.96 mins 三乙膦酸铝 m/z 109>81 - min △=0.53 mins m/z 81>79 膦酸 图3.展示了同分异构化合物的色谱分离结果的典型色谱图，基质匹配标准曲线分析菠菜样品，加标浓度为0.1mg/kg(100 ppb)。 在适合的浓度范围内采用分段校准法评估目标农药的响应线性，如图4所示。示得的相关系数和残差(现在SANTE文件中被称为反算浓度)都非常出色(r²>0.99且残差<20%)，证明该方法即使不使用内标也具有良好的重现性。 图4.一组阴离子型极性农药的校准曲线，以菠菜为检测样品，其中的农药浓度范围为0.0075至0.20 mg/kg (7.5~200 ppb)。 准确度(正确性和精密度) 制备浓度为目标LOQ的五个重复样，但遗憾的是，加标浓度为0.05 mg/kg的一个重复样数据因制备错误而被剔除。用于制备加标样品的空白样中检出了了酸，因此无法计算正确性结果。使用标准加入法计算得出空白样品中检出的膦酸浓度为0.16 mg/kg。 验证结果表明，该方法定量菠菜中阴离子型极性农药的性能非常出色。在0.01和0.05 mg/kg加标水平下，该方法表现出优异的准确度(表2和表3)。精密度结果也非常理想，重现性结果(RSDr)介于1.1%至9.7%之间。使用内标可提升0.01 mg/kg水平下草甘膦和高氯酸盐的回收率。在0.01 mg/kg的加标水平下，在94%~117%范围内，其它化合物的平均回收率都非常出色。离子丰度比和保留时间与基质匹配标准品得出的参考值一致性良好，而且几乎所有结果都在要求的容差范围内。只有加标浓度为0.01 mg/kg时，AMPA和HEPA的离子丰度比稍微超出了容差范围。表4汇总了通过方法验证过程测定的菠菜中各种农药的LOQ，以及相关MRL。SANTE文件将LOQ定义为：在准确性和精密度满足方法性能标准的前提下，可以向样品中加标的最低分析物浓度。几乎所有分析物都达到了目标LOQ 0.01 mg/kg。 AMPA和HEPA的LOQ被定为0.05 mg/kg，这完全是因为其离子丰度比的计算结果略微超出了标准。 表2.方法验证结果汇总--菠菜中阴离子型极性农药加标浓度为0.01mg/kg。 参数 RT (min) 离子丰度比 残差 回收率 RSDr 标准 范围 ±0.1 范围 ±30% ≤20% 70-120% ≤20% 草甘膦 2.99-3.00 2.89-3.09 0.29-0.41 0.26-0.48 <13% 77% 3.3% AMPA 1.86-1.90 1.77-1.97 0.54-0.80 0.43-0.79 <15% 102% 9.0% 草铵膦 2.40-2.42 2.31-2.51 0.85-1.16 0.68-1.26 <14% 113% 6.0% NAG 2.90-2.90 2.82-3.02 0.55-0.65 0.41-0.76 <20% 94% 4.1% MPPA 2.33-2.33 2.23-2.43 0.56-0.62 0.41-0.76 <14% 117% 1.4% 乙烯利 2.84-2.84 2.75-2.95 0.23-0.29 0.23-0.42 <13% 106% 2.5% HEPA 2.76-2.77 2.67-2.87 0.27-0.40 0.34-0.63 <14% 110% 2.1% 三乙膦酸铝 2.83-2.83 2.73-2.93 0.12-0.14 0.09-0.16 <14% 105% 2.8% 膦酸 3.35-3.37 3.26-3.46 0.10-0.10 0.08-0.14 N/A N/A 7.5% 氯酸盐 2.73-2.74 2.64-2.84 0.05-0.07 0.04-0.07 <18% 101% 9.7% 高氯酸盐 1.72-1.72 1.62-1.82 0.04-0.05 0.03-0.06 <19% 72% 5.9% 表3.方法验证结果汇汇--菠菜中阴离子型极性农药加标浓度为0.05 mg/kg。 参数 RT (min) 离子丰度比 残差 回收率 RSDr 标准 范围 ±0.1 范围 ±30% ≤20% 70-120% ≤20% 草甘膦 2.99-3.00 2.89-3.09 0.38-0.40 0.26-0.48 <13% 101% 2.7% AMPA 1.87-1.88 1.77-1.97 0.56-0.72 0.43-0.79 <15% 94% 1.8% 草铵膦 2.40-2.43 2.31-2.51 0.89-1.06 0.68-1.26 <14% 106% 1.2% NAG 2.90-2.94 2.82-3.02 0.58-0.62 0.41-0.76 <20% 100% 3.4% MPPA 2.33-2.34 2.23-2.43 0.56-0.59 0.41-0.76 <14% 111% 3.3% 乙烯利 2.84-2.87 2.75-2.95 0.29-0.33 0.23-0.42 <13% 93% 1.1% HEPA 2.76-2.79 2.67-2.87 0.39-0.46 0.34-0.63 <14% 98% 2.2% 三乙膦酸铝 2.83-2.86 2.73-2.93 0.12-0.13 0.09-0.16 <14% 103% 1.2% 膦酸 3.35-3.39 3.26-3.46 0.09-0.11 0.08-0.14 N/A N/A 7.3% 氯酸盐 2.73-2.78 2.64-2.84 0.05-0.07 0.04-0.07 <18% 106% 2.5% 高氯酸盐 1.72-1.76 1.62-1.82 0.05-0.05 0.03-0.06 <19% 90% 1.5% 表4.方法验证结果汇总--菠菜中阴离子型极性农药LOQ值和相关MRLs。 参数 LOQ (mg/kg) EU MRL (mg/kg) 草甘膦 0.01 0.1 AMPA 0.05 无 草铵膦 0.01 0.06 NAG 0.01 作为草铵膦的一部分 MPPA 0.01 作为草铵膦的一部分 乙烯利 0.01 0.05 HEPA 0.05 无 三乙膦酸铝 0.01 75 膦酸 N/A 作为三乙膦酸铝的一部分 氯酸盐 0.01 无 高氯酸盐 0.01 0.5 结论 应用Torus DEA色谱柱可建立一种经济有效且稳定可靠的解决方案，该方法可分析多种阴离子型极性农药及代谢物，具有卓越的色谱性能。只需单次分析即可完成测定，且无需衍生化步骤、专用设备或特殊流动相。该方法兼容现有的传统HPLC和UPLC仪器，因此可轻松应用于常规检测实验室。研究证明，该方法可用于检测样品是否符合EUMRL要求，此外还有望应用于更低浓度水平下的样品筛查(例如用于食品生产商的责任检测)。尽管本研究以菠菜为测试样品得到的方法验证数据符合SANTE标准，但科学家们仍有必要在自己的实验室内使用目标样品对该方法进行全面验证，以证明该方法配合具体的萃取方案使用时，能够达到其预期应用目的。 ( 参考文献 ) ( 4. Wuyts B， et al.(2016). Highly sensitive analysis ofpolarpesticides in f ood m atrices. Waters Technical Note No. 72 0 0 05 8 2 2 EN . October，2016. ) 5i. Wuyts B， et al.(2017). Improved multi-analytemethod for the underivatized analysis of anionicpesticides in food by LC-MS/MS. WatersApplication Note No. 720006070EN. July 2017. 6.1European Union (2017). Document No. SANTE11813/2017.Guidance Document on AnalyticalQuality Control and Method Validation Proceduresfor Pesticides Residues Analysis in Food and Feed. 扫一扫，关注沃特世微信 THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE." Waters、 The Science of What’s Possible、ACQUITY、UPLC、Xevo、MassLynx、Torus、TargetLynx和IntelliStart是沃特世公司的商标。其它所有商标均归各自的拥有者所有。 沃特斯中国有限公司 ( 沃特世科技(上海)有限公司 ) 北京：010-52093866 香港：852-29641800 免费售后服务热线：800(400)8202676 wWW.waters.com Torus DEA色谱柱的创新应用：分析菠菜中的阴离子型极性农药 Torus DEA色谱柱的创新应用：分析菠菜中的阴离子型极性农药     简介    对食品或饲料生产中用作原料的农作物施用农药而导致的农药残留问题是威胁公众健康的一大风险因素。各个国家/地区都为此建立了全面的法规体系，针对活性成分的审批、农药的使用，以及食品中农药的最大允许残留量给出了明确标准。残留物是通过评估活性成分确定的，可能包括相关代谢物及其它转化产物。食品监管检测项目会检测产品是否符合农药最大残留量(MRL)或可接受标准、评估膳食摄入量，还会检查产品是否使用了未经批准的农药。    食品行业本身也会出于责任、品牌保护或产品出厂检验等目的，对原料和成品进行检测。有些极性农药极为常用，因此需要稳定的方法来监测它们在食品中的残留，以确保残留量符合当地法规规定的最大允许限值要求。对于已获批的用途，其MRL通常比较高(以大麦中的草甘膦残留为例，欧盟规定的MRL为20 mg/kg1，美国规定的MRL为30 mg/kg2)。而对于未规定MRL的用途，默认采用“检测限或检测限左右”作为MRL。尽管上述法规限值高于大部分其它农药的限定值0.01 mg/kg，但在过去几年间，新规定的限值已经降至0.3～0.1 mg/kg。为了促进贸易，一些国家/地区针对某些极性农药规定了临时MRL或国家/地区干预限值。    尽管现在已经有不少多残留LC-MS/MS方法可用于分析食品中的农药残留，但仍有一些农药不适合采用这些通用方法进行分析，原因是这些农药的极性和/或离子强度太高，导致其难以成功被萃取出来，并且/或者在常用的C18色谱柱中保留性能较差。过去，人们采用一系列具有专属选择性的单残留方法单独分析这些化合物，分析成本极高，因此监管计划往往会将这些分析物排除在外。QuPPe(极性农药快速提取)方法3可同时提取多种强极性农药及其代谢物。QuPPe方法通常需要配合高灵敏度的LC-MS/MS仪器，目的是解决粗提取物(未净化)中显著的基质效应问题。    结论    应用Torus DEA色谱柱可建立一种经济有效且稳定可靠的解决方案，该方法可分析多种阴离子型极性农药及代谢物，具有卓越的色谱性能。只需单次分析即可完成测定，且无需衍生化步骤、专用设备或特殊流动相。该方法兼容现有的传统HPLC和UPLC仪器，因此可轻松应用于常规检测实验室。研究证明，该方法可用于检测样品是否符合EU MRL要求，此外还有望应用于更低浓度水平下的样品筛查(例如用于食品生产商的责任检测)。尽管本研究以菠菜为测试样品得到的方法验证数据符合SANTE标准，但科学家们仍有必要在自己的实验室内使用目标样品对该方法进行全面验证，以证明该方法配合具体的萃取方案使用时，能够达到其预期应用目的。