奶粉中抗生素检测方案(感官智能分析)

农业工程学报Transactions of the CSAE第27卷 第4期2011年 4月Vol.27 No.4Apr. 2011 361 农业工程学报2011年362 电子舌检测奶粉中抗生素残留 谈国凤，田t师一2，沈宗根3，张根华3，邓少平 2※ (1.工苏大学食品与生物工程学院，镇江212013； 2.浙江工商大学食品感官科学实验室，杭州310035；3.常熟理工学院生物与食品工程学院，苏州215500) 摘 要：为了找到能快速检测乳制品中抗生素残留的方法，该文利用电子舌对奶粉中相同质量浓度的6种抗生素进行了辨识，并对新霉素检测质量浓度进行了初步研究。采用铂、金、钯、钨、钛和银6个电极组成的传感器阵列和1、10和100 Hz3个脉冲频率进行检测，并通过主成分分析、线性判别分析和偏最小二乘法进行数据分析。结果显示：电子舌对不同种抗生素和不同质量浓度的新霉素具有较好的辨识能力，定性分析能够达到国家最高残留限量标准；利用偏最小二乘法(PLS)建立模型定量分析，新霉素最适检测质量浓度范围在300~1 100 ug/L 附近。电子舌依据其独特的优点，为食品掺杂掺假的检测提供了新的思路和方法。 关键词：抗生素，主成分分析，智能传感器，，日电子舌，新霉素，线性判别分析，偏最小二乘法 doi： 10.3969/j.issn.1002-6819.2011.04.063 中图分类号：TP212.9 文献标志码：A 文章编号：1002-6819(2011)-04-0361-05 谈国凤，田师一，沈宗根，等 电子舌检测奶粉中抗生素抗留[J].农业工程学报，2011，27(4)：361-365. Tan Guofeng， Tian Shiyi， Shen Zonggen， et al. Electronic tongue detection for residual antibiotic in milk powder []. Transactions ofthe CSAE， 2011，27(4)：361-365. (in Chinese with English abstract) 引 言 某些微生物或动植物所产生的物质(例如青霉素)能抑制另一些微生物细胞壁、细胞膜、蛋白质的合成，核糖核酸和脱氧核糖核酸的转录复制，抗代谢物溶菌酶形成的化学物质统称为抗生素。抗生素可用于治疗人或家畜的疾病，对泌乳期奶牛用药不当或用药治疗后停止用奶时间不够容易造成牛乳中抗生素残留，尤其是采用乳房灌注治疗奶牛乳房炎时，更易造成牛乳中抗生素的残留2。牛奶中若含有抗生素，对长期饮用者来说无疑等于长期服用小剂量的抗生素，而对于有过敏体质的人服用残留抗生素的牛奶后会发生过敏反应，如皮疹、过敏性休克等，即使是正常体质的饮用者也会由于服用残留抗生素的牛奶而破坏肠道内的菌群平衡，，引发胃肠疾病和生理紊乱，降低人体免疫功能3。因此，牛奶中抗生素的残留严重危害人体的身体健康和生命安全；从乳制品加工的角度来看，原料乳中抗生素残留物严重干扰发酵乳制品的生产，抗生素可严重影响干酪、黄油、发酵乳 ( 收稿日期：2010-09-07 修订日期：20 1 1-03-30 ) ( 基金项目：苏州市社会发展项目(S Z D0927)；苏州市农业科技攻关项目(SNG0836)；苏州市食品品质与安全重点实验室项目(SZSZD0904)；多频脉冲电子舌电化学机理研究，博士学科点专项科研基金(200803530002)； ) ( 脉冲弛豫组合谱电子舌信号响应机理的基础研究，省自然科学基金(Y3090523)；食品微生物快速检测的新型电子舌研究 ， 省科技厅 (2009C33046) ) ( 作者简介：谈国凤(1985一 ) ，女，江西南昌人，研究方向为食品科学与工程。镇江江苏大大食品与生物工程学院，212013。 ) ( Email： 373902087@qq.com ) ( ※通信作者：邓少平(1957一)，男，博士生导师，主要从事感官科学及相关研究。杭州 浙江工商大学食品感官科学实验室，310035。 ) ( Email： spdeng@hzic.edu.cn ) 的起酵和后期风味的形成4。 目前，牛奶中抗生素残留的检测方法大致分为3类：生物测定法、免疫法、理化分析法。但是都存在很多缺点，如检测时间长，样品前处理繁琐，试剂成本较高等。电子舌是一种模拟人类味觉感受机制。以传感器阵列为基础结合模式识别对被测样品综合性质分析检测的仪器。具有检测时间短、样品无需前处理等优点6。本课题组自主研发的电子舌是以惰性金属传感器为基础、多频大幅脉冲为激发信号的新型智能伏安型电子舌17-8]，，目前已在白酒、葡萄酒、饮料19-11]等多种食品中取得良好的应用效果。本文利用电子舌系统检测奶粉溶液中掺入的抗生素，并以新霉素为例探索电子舌在乳制品中抗生素残.留定性和定量检测能力。 材料与方法 1.1 试验材料 符合食品卫生安全标准的进口奶粉：市售惠氏金装爱儿乐婴儿奶粉。购于生工生物工程(上海)有限公司的6种抗生素：金霉素；大观霉素；红霉素；林可霉素；新霉素；庆大霉素。 1.2 主要仪器与检测方法 检测仪器为电子舌，由本试验室自主研发。电子舌由传感器阵列、多频脉冲扫描仪和智能算法3个部分组成(见图1)，是以多频率大幅脉冲作为激发扫扫信号，通过几种特定的贵金属传感器组成的传感器阵列，检测被测物质整体特征性响应信号，辅以主成分分析等数学方法而构建的新型电子舌系统。电子舌采用标准的三电极系统，由铂电极(Pt)、金电极(Au)、钯电极(Pd)、钨电极(Wu)、钛电极(Ti)和银电极(Ag)6种不同 的非修饰金属电极组成工作电极，辅助电极为铂电极，参比电极为 Ag/AgCl电极，外盐桥使用饱和氯化钾。以常规大幅脉冲激发信号为基元模式，每个脉冲频率段的大幅脉冲的脉冲幅度均采用相同脉冲幅度变化，从+1.0V开始，然后每次变化0.2V，一直到-1.0V。同时，采用了1、10和100Hz 3 个脉冲频率段，比常规脉冲采集的信息量更大。 本试验在测量样品之前，都要将6种金属传感器组成的传感器阵列置于空白奶粉溶液中，以3个频率大幅脉冲作为激发扫描信号进行预扫描并进行标准化处理，使响应信号趋于稳定并消除漂移现象，然后依次置于盛有约 15 mL 待测液的25 mL烧杯中进行检测，检测时间为180 s， 每次测量前后，对传感器都要进行电化学清洗，清洗时间为90s，提取响应电流信号的物理化学特征值，利用电子舌自带的数据处理软件对数据进行采集、分析和模式识别。 图1 电子舌结构示意图 Fig.1 Structure diagram of smartongue 1.3 试验方法 1.3.1 奶粉溶液的准备 根据泡制奶粉要求，奶粉和水的比例为 8.5 g ： 60mL，称取 85 g奶粉，用600 mL 100℃纯净水冲泡，充分溶解后，冷却至室温，制得质量浓度约为 1.03g/mL 的奶粉溶液。 1.3.2 抗生素溶液的准备 分别称取0.1g金霉素，大观霉素，红霉素，林可霉素，新霉素，庆大霉素，加超纯水100 mL 制得体积质量浓度为1 g/L 溶液待用。 1.3.3 抗生素-奶粉溶液的配置 用移液枪吸取 50 uL 抗生素溶液，用冷却的奶粉溶液定容至 100 mL 容量瓶中，分别配置 500 ug/L6 种抗生素-奶粉溶液；以中华人民共和国农业部公告第235号112]中规定乳制品中新霉素的最高残留限量标准500 pg/kg(约515 ug/L)为依据，设计并配置不同质量浓度的新霉素-奶粉溶液(见表1)。 表1 不同体积质量浓度的新霉素-奶粉溶液 Table 1 Different concentrations of neomycin-milk powdersolution 编号 质量浓度/(ug·L) 编号 质量浓度/(ug·L) A E 800 B 200 F 1000 C 400 G 1200 D 600 1.4 数据处理方法 1.4.1 主成分分析 主成分分析113] (principal component analysis， PCA)是模式识别中最基本的多元统计分析方法，它在保留原始变量主要信息的前提下将多指标问题转换成少数几个综合指标(即主成分)，起到降维与简化问题的作用，主成分的累计方差大于总方差的85%，则基本可以代表原数据的特征。主成分得分图以散点图为基础，每个点代表一个样品，点之间的距离代表样品之间特征差异的大小。采用 Matlab 7.1 软件编写的 smartongue 数据处理软件处理。 1.4.2 线性判别式分析 线性判别式分析[14-15] (linear discriminant analysis，LDA)是一种常用的分类方法，这种数学分类规则可将N维空间分成一些子空间，并将其定义在直线、平面或超平面上。LDA 选择能够最大程度分开所给各类的分割面作为它的方向，即找到一个函数，该函数的变量为原始变量的线性组合，称之为正规变量。这种计算判别函数的方法可以使组间变异与组内变异的比率达最大，可直观的看出梯度浓度样品的整体线性趋势，为进一步的定量分析及线性拟合提供依据。本试验采用 Matlab 7.1软件编写的自带数据处理软件处理。 1.4.3 偏最小二乘法 偏最小二乘法1161 (partial least square method， PLS)是-种高效抽提信息的方法，在建模过程中集中了主成分分析，典型相关分析和线性回归分析方法的特点，因此在分析结果中可以提供一个更为合理的回归模型，已作为-一种标准的多元建模工具。PLS建立2个矩阵：X和Y，其原则是寻找输入矩阵(X)的那些与输入变量尽可能相关的成分，同时与Y矩阵的目标值达到最大相关。在试验数据处理过程中，X由传感器响应信信矩矩阵成，Y由样品中抗生素质量浓度矩阵构成，采用 TheUnscrambler V 9.1 软件中的偏最小二乘法分析。 2 结果与分析 2.1 相同质量浓度(500 ug/L) 不同抗生素的主成分分析 分别用6个工作电极3个频率段对空白奶粉溶液和含有不同抗生素的共7种奶粉溶液进行检测，对检测所得数据进行主成分分析。在金电极1Hz， 钛电极1Hz 和银电极1Hz频率段下区分效果最好，得到主成分1、主成分2的主成分分析(PCA)得分图，如图2所示，图中每一小圈代表这种样品的整体特性，其中6个记号点分别代表此样品的6个重复样品，主成分1和主成分2保留了原始数据87.3%的信息量。不同样品的类间品质差异可以通过主成分得分图上的距离表征，2类样品的距离越近说明其品质特性越相似。 从图2可以看出，未添加抗生素的奶粉溶液和添加抗生素的奶粉溶液在主成分图上可以很好地区分开来。且不同种类的抗生素之间，相互距离较远，差异性越大。 图2相同质量浓度(500 ug/L)的6种抗生素-奶粉溶液的主成分得分图 Fig.22PPCA score plot of 500 ug/L mass concentration of six kindsof antibiotic-milk powder solution 新霉素与其他的抗生素之间差异最大，林可霉素和大观霉素差异较小，金霉素和大观霉素差异较大。电子舌对奶粉溶液中不同抗生素的区分能力为电子舌建立相应的抗生素定性定量系统提供了可能。 2.2 不同质量浓度新霉素的线性判别分析 对空白奶粉溶液和含有不同质量浓度新霉素奶粉溶液进行检测所得数据进行线性判别分析。图3为样本点在线性判别空间的第一一和第二正规变量空间构成的平面的分布结果。其中每个圈中的8个记号点分别代表此样品的8个重复样品。由软件处理结果得：第一和第二正规变量空间构成的平面所涵盖的方差变异占整个数据矩阵方差变异的93.9%。这样，样本在第一和第二正规变量空间构成的平面中的分布情况可基本代表样本在始变量空间的分布状况。从图中3可以看出，空白样品和含新霉素质量浓度介于200~1200 pg/L 之间的奶粉溶液相距较远，当新霉素质量浓度在200~1000 ug/L时呈一定的线性关系，但高质量浓度的新霉素(1200ug/L附近)可能会引起检测体系电化学性质混淆，继而影响电子舌对于体系的检测，这个质量浓度有可能是电子舌对于新霉素的检测上限。 图3 样本点在线性判别空间第一和第二正规变量空间的分布 Fig.3 Distriibution of samples in CV1-CV2 ordinates by lineardiscriminant analysis 2.3 新霉素偏最小二乘法定量分析 将6个工作电极3个频率段对不同质量浓度的新霉素-奶粉溶液进行检测所得数据建立偏最小二乘回归 PLS模型。结果显示在在电极1 Hz 频率段下效果最好，故以每个样品的检测信号特征值矩阵组成X变量，以7个浓度梯度值构成的列向量为Y变量，对20个主成分进行内部交互验证，建立 PLS 模型。在交互验证过程中，以校正样品集的交互验证均方根误差(root mean square errorof cross-validation， RMSECV)和预测残差平方和I17](predicted residual error sum of squares， PRESS)为优化参数，选择最适主成分数，考察主成分数对 RMSECV 和PRESS 值的影响， 当 RMSECV 和 PRESS 值均最小时，所选主成分数最佳。由图4可以看出，当主成分数为11时，模型有最小的RMSECV 和 PRESS 值；当主成分数继续增加时，两者均有上升趋势，可说明最佳主成分数为11。在选好主成分数的条件后，使用 PLS 对校正组的数据建立模型，决定系数为0.978(图5)，图中每个数字代表一个样品测试编号，由图5可以看出，除个别样品偏差较大，相同样品聚合在一起的程度较高，且含有不同质量浓度新霉素的奶粉溶液呈现很好的线性关系，所建立的模型具有较高的相关性。 图4 新霉素-奶粉溶液最小偏二乘回归(PLS)模型主成分个数对 PLS定量分析模型的交互验证均方根误差(RMSECV)及预测残差平方(PRESS)值的影响 Fig.4 Effect of the number of PCs on root mean square error ofcross-validation (RMSECV) and predicted residual error sum ofsquares (PRESS) value in the partial least square method (PLS)model of neomycin-milk powder solution 图5 新霉素-奶粉溶液最小偏二乘回归模型 Fig.5 Partial least square method model of neomycin-milkpowder solution 建立最优模型后，用100、300、500、700、900、1100和1300 ug/L 的新霉素-奶粉溶液各2个样品进行预测。用最优模型对检测所得数据进行新霉素质量浓度的预测，预测结果以及相对误差列于表2，线性关系如图6所示。从表2和图6可以看出：除去1、2、13和14号样品的预测结果相对误差较大，其余样品预测相对误差均在10%以内。结果表明：当新霉素质量浓度在300~1100ug/L 之间时，该模型具有较好的预测能力，与图3线性判别分析定性分析结果基本一致。总体来说，利用 PLS建立模型具有较高的精确度，新霉素最适检测质量浓度范围在 300~1100 pg/L 附近。 表2 最佳校正模型预报新霉素质量浓度结果 Table 2 Results ofthe prediction of mass concentration ofneomycin by optimal correction model 样品编号 实际质量浓度/ 预测质量浓度/ 相对误差 (ug·L") (ug·L) /% 100 112.754 12.75 2 100 119.379 19.38 3 300 284.996 5.00 4 300 311.513 3.84 5 500 509.693 1.94 6 500 498.652 0.27 7 700 757.306 8.19 8 700 742.103 6.01 9 900 935.846 3.98 10 900 879.432 2.29 1 1100 1180.504 7.32 12 1100 1001.283 8.97 13 1300 1476.301 13.56 14 1300 1492.094 14.78 图6 最佳校正模型预报新霉素质量浓度结果 Fig.6Results of the prediction of mass concentration ofneomycin by optimal correction model 3 结 论 1)电子舌对抗生素具有良好的检测区分效果，利用主成分分析对数据进行处理结果显示：电子舌能同时区分不含抗生素的空白奶粉溶液和6种质量浓度为500ug/L 不同种类的抗生素-奶粉溶液。 2)采用线性判别法对电子舌检测结果分析表明，电子舌对不含新霉素的空白奶粉溶液和含新霉素质量浓度 为200~1200 ug/L 奶粉溶液具有显著的区分效果；当新霉素质量浓度在200~1 000 ug/L之间时，电子舌能区分各奶粉溶液，，能够达到国家最高残留限量标准；；当新霉素质量浓度增加到 1200 ug/L 时，电子舌表现出较弱的检测能力。 3)采用偏最小二乘法对电子舌检测质量浓度为 0~1200 ug/L 新霉素-奶粉溶液的结果建立模型，除100和1300 ug/L 以外，已建立的模型对新霉素的预测都较为准确。下一阶段将对其他单一抗生素及混合抗生素建立相应的定性和定量模型。 ( [参 考 文 献1 ) ( 1] 马兆瑞，祝战斌，卡尔·莱金特.乳和乳制品中残留抗生素 的检测方法[J].中国乳品工业，2003，31(4)：37-39. 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Platinum， gold， palladium， tungsten， titanium and silver electrodes as sensor arraywere used in this experiment and detected at different frequency of 1 Hz， 10 Hz and 100 Hz. Principal componentanalysis， linear discriminant analysis and partial least square method were used to analysis the experiment data. Theresults showed that smartongue could well discriminate different antibiotic and different concentration of neomycin，qualitative analysis result could reach the national maximum residue limit standard basically. A optimal concentrationrange of neomycin about 300-1100 ug/L was obtained by quantitive model established by partial least square method.Smartongue provide a new method to detect adulterations in food by its special advantages. Key words： antibiotics， principal component analysis， smart sensors， smartongue， neomycin， linear discriminant analysis，partial least square method ◎China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http：//www.cnki.net 为了找到能快速检测乳制品中抗生素残留的方法，该文利用电子舌对奶粉中相同质量浓度的6 种抗生素进行了辨识，并对新霉素检测质量浓度进行了初步研究。采用铂、金、钯、钨、钛和银6 个电极组成的传感器阵列和1、10 和100 Hz 3 个脉冲频率进行检测，并通过主成分分析、线性判别分析和偏最小二乘法进行数据分析。结果显示：电子舌对不同种抗生素和不同质量浓度的新霉素具有较好的辨识能力，定性分析能够达到国家最高残留限量标准；利用偏最小二乘法（PLS）建立模型定量分析，新霉素最适检测质量浓度范围在300～1 100 μg/L 附近。电子舌依据其独特的优点，为食品掺杂掺假的检测提供了新的思路和方法。