制药原料中制药原料稀释液鉴别检测方案(激光拉曼光谱)

分析学 免费服务热线：8008105118 4006505118(手机用户) PharmaceuticalThe Industry's Authoritative SourceTechnology 使用手持式拉曼光谱仪鉴定 198种常见原料的方法 Robert L. Green， Robert Brush， Wayne Jalenak， and Christopher D. Brown 采用手持式拉曼光谱仪，开发出针对198 种广泛用作原料的物质的方法，并进行了评估。每种方法开发仅需一个样品，采集样品的单个参考光谱。方法建立后，被直接转移至单独的手持式拉曼光谱仪。测试所有方法和样品的匹配，共进行了近 40，000次挑战测试。正确验收率达 100%；正确剔除率达99.9%。 Robert L. Green* 是一名研究科学家； Robert Brush 是一名应用科学家； Wayne Jalenak 是一名高级应用科学家； Christopher D.Brown 是系统分析与应用部主管。他们均就职于 Ahura Scientific 药品制造商们都在寻求一种既可降低制造成本(包括原料分析测试成本)又可维持并提高产品质量的方法。此外，寻找更具成本效益的测试技术还有以下驱动因素：逐步实现100%原料检验，提高生产量，以及追求精益生产。 拉曼光谱法固有的选择性使其成为对药品原料(1-3)进行定性鉴定的有效选择。对于相对较弱但选择性较高的拉曼散射效应，在检测方面面临技术难题，故其使用至今较为困难。10年来，电荷耦合原件(CCD)检测器的灵敏度、波长更长的二极管激光的可用性及瑞利滤光片的研制均有改进，使拉曼光谱法适用于常规应用。此外，光学组件的微型化促进了便携式手持拉曼光谱仪的研发，此光谱仪可穿透透明包装材料(例如：玻璃和塑料)进行可靠的材料鉴别(4)。 《美国药典》通则(1120)公认拉曼光谱法为材料特性鉴定的认可技术之一，并声称： “由于拉曼光谱针对给定化合物的谱图是特定的，故拉曼定性测量既可用作药典鉴别测试，也可用于结构测定”(5)。正如该说法指出的，拉曼光谱法的固有特性(即：离散峰与特定分子键振动对应)有利于对各种不同原料进行鉴别。 图1：基于拉曼光谱技术的 TruScan 手持式材料鉴别确认系统。 拉曼光谱法除具有较高的分子选择性外，对粒度、湿度及包装材料影响因素等物理和环境因素相对不敏感。当使用拉曼时，这种不敏感性与高度的分子选择性相结合有利于进行非常简单的方法开发。事实上，一种方法通常基于单个参考光谱(4)。 拉曼光谱法的分子选择性较高，对外部因素不敏感，有助于消除与在多台仪器间实现方法转换有关的问题。仪器工程学设计精细，提供一致的光谱平台用于采集和共享数据，凭借全面的系统响应特征，使在一台设备上开发的方法可在任何其他设备间进行无缝共享，从而节约时间和成本(4)。 相比实验室测试，便携式现场光谱仪有许多操作优点，但须考虑此项技术所带来的挑战，例如：无法控制测试环境(温度、湿度和环境照明等)。现场所用仪器专门针对现场使用场景设计，可自动补偿环境光线和采样夹具等外部变量以及被分析材料中的光谱差异。 评估任何一种分析方法都需考虑最后一项重要因素，即所能达到的方法性能。就鉴别测试而言，特异性(即选择性)是整个验证过程中都须说明的品质因数(6)。当根据光谱数据进行特性评估时，应检查与一个或多个参考光谱相关的未知测量结果。尽管可通过比较峰位置手动完成最终评估，但通常进行全谱自动分析。分析时，做出最终决定所用的运算方法显然对确定特异性水平具有重要作用。光谱比较的常用方法包括命中率指数法(HQI)和光谱相关性法(7)。这些方法有助于进行快速相似性评价，但在光谱鉴别测试过程中 图2：198种材料真阳性测试和假阳性测试p值的柱状图。 图3：在198种材料上进行仪器p值挑战性测试的选择性矩阵汇总 通常不提供直接解释。此外，这些计算方式一般对相关光谱之间的差异不敏感，故即使这些技术产生适宜的相关系数，也可能出现误判(4)。 完全多元的概率方法可替代 HQI 和光谱相关性法，该方法旨在寻找测试和参考光谱之间的光谱差异。基于测试和参考光谱在测量不确定性范围内相同的零假设，该比较被简化为传统p值(p值较小表示测试和参考光谱之间的差异较大)。若未发现显著差异(即：p值>0.05)，则设备视测试光谱与参考光谱一致，公布结果为“通过”。若发现差异(除单纯由测量不确定性引起)，则无法根据参考光谱鉴别测试材料，且结果为“失败”。 图4：氨基酸类物料的选择性矩阵。 图5：有机溶剂类的选择性生阵。 在本研究中，通过检查198种拉曼活性物质(在制药、消费者保健和个人护理产品生产中广泛用作原料)评估便携式拉曼光谱仪在原料特性鉴定方面的广泛适用性。每种鉴定方法均使用一个参考光谱进行开发。开发时间非常短，通常为近红外(NIR)方法开发所需的时间。测试不同类别的材料(见见边栏“材料类别”)。用各种方法评估每种材料，完成对选择性的全面评估，进而对每种方法的性能做出全面评估。 本研究使用5台手持式材料特性鉴定系统(TruScan，Ahura Scientific， Wilmington MA，见图1)。这些仪器采用拉曼光谱法作为分析技术，将一台785-nm NIR外腔稳频、热电制冷激光器作为光源。激光器通常以300mW输出运行，可在需要避免检测器饱和时自动调节。这些仪器还包括一台单程色散光谱仪、一个制冷 CCD检测器阵列和瑞利散射介质边缘滤光片。各仪器均配集成条码阅读器，可用于选择方法，采集样品批号/批次/其它标识符。表Ⅰ所示为 TruScan 拉曼材料特性鉴定系统的规范。 自动采集模式可实时监测输入数据，自动调整控制设置(例如：激光功率、曝光时间、曝光次数)，在两次测量之间达到同等统计分辨能力，故可促进光谱采集。此光谱学自适应方法可确保各种操作条件下仪器的统计性能一致，并嵌入决策算法。 使用四台仪器(以下称为参考装置)采集本研究所包含的198种材料的参考光谱(见侧边栏， "被测材料”)。为获得参考光谱，使用小瓶适配器附件将硼硅玻璃瓶( Kimble Glass， Vineland， NJ)中的各材料参考样品置于装置激光孔的正确位置。在自动模式下采集所有数据。针对测试光谱，多数分析在一分钟内完成。用于建立方法的参考光谱也在自动模式下采集；但是，这些光谱的信噪比标准高于标准测试光谱，故需较长的数据采集时间。多数自动模式参考光谱均可在30分钟内采集到。若扫描未在45分钟内自动停止，为防止光漂漂，在45分钟时手动停止扫描。 可使用紧凑型闪存卡或通过 TCP/IP 连接寻址装置的标准网页浏览器在 TruScan 设备间传送参考光谱。采用这些方法，参考光谱可从四台参考设备传送至测试设备上。待所有参考光谱转移至测试设备后，使用 TCP/IP实用程序 WebAdmin 为 198种材料创建新方法，每种方法仅使用一张参考光谱。就 TruScan 装置而言，方法为基于存储参考光谱的分析任务，仪器通过执行分析任务来确定是否可鉴定材料特性。 图6：长链烃的选择性矩阵 醇/酸/碱 香精/香料 氨基酸 普通无机物 抗生素 普通有机物 止泡剂 单体/聚合物 抗氧化剂 多元醇 活性药物成分 防腐剂/抗菌剂/杀虫剂 粘合剂 溶剂 缓冲剂 甜味剂 稀释液 增稠剂/乳化剂/稳定剂 润肤剂/润滑剂/涂层 维生素/矿物质 脂肪酸 为挑战方法，将每种材料的试样置于硼硅玻璃瓶中，再将玻璃瓶插入测试装置的管架中。针对每种试样，在自动模式下采集光谱。随后，机载处理器对各材料开发的方法和从各测试材料中采集的光谱进行评估，同时对198种材料中其它材料创建的所有方法进行评估，针对方法共产生 39，204个测试光谱评估果果。除测试设备通常显示的通过和失败结果外，还记录每个试样-方法评估配对的p值。 结果和讨论 每当针对一种材料的方法测试产生的结果p值≥0.05时，手持式拉曼材料鉴别确认系统显示结果通过。通常，当测试“错误”材料的方法时，p值远低于0.05，导致结果失败。 图2以柱状图形式总结了本研究所测试的198种材料所有配对产生的p值。绿条代表针对相应的相同材料方法对材料进行测试时得出的结果(真阳性测试)，红条代表针对其他方法对材料进行测试时得出的分析(假阳性测试)。在同一张图中查看两种结果集时，柱状图y轴代表各直条中样品分数，而非各直条中的样品总频率。真阳性测试结果(绿色)均超出通过阈值，p值范围为0.052~>0.5。 尽管假阳性测试显示出几个p值高达0.15的阴性样品，远高于通过阈值，故视为假阳性，但假阳性出现的频率极低，以致无法在柱状图上看到p值>0.05的阴性样品。相反，柱状图所示的阴性样品表明：就使用不同材料进行测试的方法而言，超过99%的配对得出的p值低于10-13，远远低于通过阈值，因此最终结果为“失败”。其表明使用手持式拉曼光谱仪可实现的选择性的极端程度。 图2柱状图中的数据同时可被编辑为选择性矩阵(见图3)，从而提供不同视角的信息。图3含198行，198列(39，204个方法-测试材料配对)，p值<0.05(对应“通过”结果)以红色表示，p值≥0.05(对应“失败”结果)以绿色表示。图3中沿对角线的绿色显示针对相应材料测试方法时，测试设备公布通过结果的情况。绝大多数非对角线位置上的红色表明针对错误材料测试方法时，设备公布失败结果的情况。由图3可知，除六组配对以外的所有配对，当针对相同材料测试材料方法时，测试设备指示通过，针对所有其他材料进行测试时则指示失败。 图3所示的六组配对出现假阳性结果的原因是每对材料组分和/或分子结构具有极高相似性。例如具有高浓度亚油酸的红花油，还例如聚维酮和交聚维酮。除交聚维酮是交联外，二者结构完全相同。每对材料之间的微小差别不会导致拉曼光谱出现显著差异。 1，3-丙二醇 2-吗啉乙磺酸 (MES) 2，2'-偶氮二异丁腈 2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇(TRIS) 3-(N-吗啉)丙磺酸(MOPS) 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES) 6-己内酯 乙酰磺胺酸钾 对乙酰氨基酚 醋酸 丙酮 乙腈 丙烯酸 腺嘌呤盐酸盐 己二酸 醋酸铵 氯化铵 磷酸氢二铵 硫酸铵 氨苄青霉素 阿司帕坦 苯甲醛 氯化苯甲烃铵 苯甲酸 苯甲醇 β-胡萝卜素 β-环糊精 维生素H(B7) 咖啡因 碳酸钙 磷酸氢钙二水合物 磷酸氢钙 硫酸钙 硫酸钙二水合物癸酸 辛酸 巴西棕榈蜡 鲸蜡醇 甲氰咪胍 一水柠檬酸 无水柠檬酸 玉米淀粉 聚氧乙烯蓖麻油 交聚维酮 环己烷 D-(+) 阿拉伯糖 D-(+)岩藻糖 D-(+)-麦芽糖一水合物 D-(+)-甘露糖 D-(+)-海藻糖 D-(+)-木糖 糊精(来自玉米) 氢溴酸右甲吗南 无水葡萄糖 一水葡萄糖 二甘醇 二甲聚硅氧烷(PDMS) 二甲亚砜 乙二胺四乙酸二钠 DL-蛋氨酸砜 DL-异亮氨酸 DL-白氨酸 DL-正亮氨酸 盐酸肾上腺素 乙醇 丙烯酸乙酯 乙基纤维素 乙二胺四乙酸 乙二醇 鱼油 叶酸(B9) 果糖 富马酸 氨基葡萄糖盐酸盐 甘油 甘氨酸 庚烷 己烷 过氧化氢 羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯布洛芬 咪唑 异丙醇(IPA) 肉豆蔻酸异丙酯 乳酸 乳糖一水合物 L-精氨酸 _-精氨酸单盐酸盐 月桂酸 L-胱氨酸 L-谷氨酰胺 L-组氨酸 柠檬烯 亚油酸 L-亮氨酸 L-蛋氨酸 L-脯氨酸 L-色氨酸 L-酪氨酸 硬脂酸镁 硫酸镁 苹果酸 麦芽糖醇 甘露醇 葡甲胺 薄荷醇 甲醇 乙酸甲酯 甲基乙基酮(MEK) 甲基丙烯酸甲酯 对羟基苯甲酸甲酯(钠盐) 二氯甲烷 微晶纤维素 肉豆蔻酸 十四烷基三甲基溴化铵 萘普生 正丁胺 N-2-环已胺基乙磺酸(CHES) N-环己基-2-羟基-3-丙磺酸(CAP-SO) 烟酸(B3) 烟酰胺(B3) 硝酸 尼龙6 尼龙6/6 辛烷 辛基酚聚氧乙烯醚(Triton X-100))十八烯酸 橙油 棕榈酸 花生油 青霉素钾 青霉素钠 青霉素Ⅴ钾 苯酚 磷酸 聚乙烯醇 聚乙二醇(380-420) 聚对苯二甲酸乙二醇酯 聚山梨酯20(吐温20) 聚乙烯吡咯烷酮(PVP或聚维酮) 碳酸钾 柠檬酸三钾一水合物 硝酸钾 无水磷酸氢二钾 磷酸二氢钾 酒石酸钾钠 丙酸 对羟基苯甲酸丙酯(钠盐)丙二醇 吡啶 视黄酸(维他命A酸) 红花油 二甲基硅油 乙酸钠 三水乙酸钠 苯甲酸钠 碳酸氢钠 碳酸钠 柠檬酸钠 环己基氨基磺酸钠 十二烷基硫酸钠(SDS) L-抗坏血酸钠 焦亚硫酸钠 钼酸钠 二水钼酸钠 磷酸氢二钠 磷酸二氢钠 磷酸二氢钠一水合物 二磷酸二钠 糖精钠 丁二酸钠 山梨酸 山梨醇酐单棕榈酸酯 山梨醇 硬脂酸 琥珀酸 蔗糖 磺胺 硫酸 酒石酸 牛磺酸 四氢呋喃(THF) 盐酸硫胺素(B1) 硫胺素焦磷酸 胸腺嘧啶 百里香酚 二氧化钛 维生素E 甲苯 柠檬酸三丁酯 柠檬酸三乙酯 三甘醇 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐尿素 香草醛 白蜡 木糖醇 七水硫酸锌 *材料来源： Fisher Scientific (Pittsburgh， PA)、Fluka (Milwaukee， WI)、ISP Technologies (Wayne， NJ)、Sigma Aldrich (St. Louis， MO)、Spectrum Chemical (Gardena， CA) 及 Supelco (Bellefonte， PA)。 表1：仪器规格参数 光谱范围 250-2900 cm 分辨率 7-10cm(最大值) 激发波长入 785nm、热电制冷、外腔稳频 输出功率 ~300mW(最大值) 激光谱线宽度 <2cmFWHM(<0.12nm) 曝光选项 自动 检测器 2048个硅元件组成的 CCD， 热电致冷 光谱仪 单程色散 探头工作距离 18mm 光斑大小 直径2mm 为增加p值结果的精度，在下列化合物等级研究中对范围进行更加精细的划分，可对设备嵌入式决策算法的鉴别能力进行更详细的评估。 氨基酸。在198种测试材料中，12种是氨基酸。图4所示为氨基酸配对的p值范围。绿条表示p值≥0.1，较测试装置的正常通过阈值(0.05)有更为严格的鉴定标准。对于所有氨基酸，测试设备均可正确鉴定每种材料，还可正确剔除不匹配材料(p值≤1×10~8)。 溶剂。测试材料还包括15种有机溶剂。图5所示为溶剂测试配对的p值范围。绿条表示p值≥0.1，较测试装置的正常通过阈值(0.05)有更为严格的鉴定标准。对于此类材料，测试装置均可正确鉴定每种材料，还可正确剔除不匹配材料(p值≤1×10~8，如图5红色方块所示)。 长链烃。图6所示为13种长链烃的P值。与前述类别测试物质不同的是，当对此类化合物的类似原料进行方法测试时，，一一些长链烃配对产生较大P值。对于大分子而言(如这些长链烃)，与分子长烃链部分相对应的拉曼信号决定着信号，使其他官能团所引起的光谱特性难以检测。其与小分子形成对比，小分子中的单个原子或官能团替代物(例如：丙酮/甲基乙基酮和钙硫酸盐/硫酸镁)易于检测。 在几乎所有情况下，如图6绿条所示，当P值大于0.1时，长链烃配对会产生排他的(完全选择性)通过结果。硬脂酸镁--山梨糖醇单棕榈酸酯配对例外。在这种情况下，长链烃 中的拉曼信号(两种材料仅差一个碳原子)覆盖分子其它部分存在的差异。如图6红条所示，一半阴性配对产生极低P值(≤1×10°)。19种长链烃配对产生的P值为0.01~0.1(如图6黄条所示)。该范围内的非对角P值表示方法之间的选择性存在明显差异(p值>0.05)或配对间隔不大(介于0.01~0.05之间)，存在选择性不充分的风险。方法确认时，鉴别这些材料至关重要，以鉴别潜在假阳性并评估风险程度。另一组(图6橙条所示54个长链烃配对)的p值范围为1×108~0.01。方法确认和稳健性测试期间，更少关注这一范围的p值。 结论 本研究通过对制药及相关行业常用的198种原料的方法性能进行广泛表征证明手持式拉曼光谱仪对制药原料鉴别的广泛适用性。每种材料的方法开发仅需一个样品。在近 40，000次方法挑战中，正确阳性鉴别率高达100%；正确剔除率高达 99.9%。 手持式拉曼光谱仪为鉴定原料特性的其他分析技术提供一种颇具吸引力的备选方法。该技术针对各种材料，方法开发和确认简单，可在仪器间直接进行方法转移，使手持式拉曼光谱仪既可提高测试原料的质量，又可削减成本。 ( 参考文献 ) ( 1 . T. Vankeirsbilck et al.， “Applications of Raman Spectroscopy inharmaceutical Analysis，” T r AC 2 1 (12)，8 6 9-877， (2002). ) ( 2. R.L. McCreery et al.， “ Noninvasive I d entification of Materials Insid e USP Vials with Raman Spectroscopy and a Raman Spectral Lib ra ry，” J . P h a rm. Sci. 87 (1)， 1-8(1998). ) ( 3. R . C antu et al.， “ A Simple Approach for Developing， Validating， and Transferringan Identification Method for Multidose Pharmaceutical Products using FT-RamanSpectroscopy，” Am . P h arm. Review 10 (2)， 96-103， 1 11(2007). ) ( 4. R.L. Green and C.D. Brown， “Raw-Material Authentication Using aHandheld Raman Sp e ctrometer，” Pha r m. Tec h nol. 32 (3)， 148-163 (20 0 8). ) ( 5. USP 32-NF 27 (1120)) “ Raman spectrometry，” p .1120. ) ( 6. ICH Q2R1 Harmonised Tri p artite Guideline， Validation o f Analytical Procedures： Text and Methodolgy (Geneva， Switzerland， 2005). ) ( 7. S.R. Lowry，， “ A utomated Sp e ctral Searching in Infrared， Raman， a nd Near-Infrared Spectroscopy，” i n Handbook of Vibrational S p ectroscopy， Vol.3 Wiley， New York， 2001)， pp. 1948-1961. PT ) 赛默飞世尔化学分析 赛默飞官方网站 ( ◎2 0 1 5赛 默 飞世尔科技 公 司 保 留所 有 权 利 。 所有商 标均归赛 默 飞世尔科技 公 司及其旗下品牌 所有 。规格 、 条款和价格随时可能进 行 更改 。 并非所有产品均可在所有国 家 提 供 。 详 情请向您当地的销售 代 表咨询。 ) 邮箱： sales.cad@thermofisher.com 网址： www.thermofisher.com