多糖酶解液中异麦芽糖检测方案(离子色谱仪)

2 3 潘媛媛，李仁勇 赛默飞世尔科技(中国)有限公司 关键词：离子色谱法； CarboPac PA10色谱柱；脉冲安培法；快速分析 目标：基于海藻糖和低聚麦芽糖的性质差异很大，本文欲通过离子色谱-电化学检测法，建立一种海藻糖和多种低聚麦芽糖的快速分离和准确测定的方法。 引言 低聚麦芽糖是淀粉或者麦芽糊精经酶水解而成的3~8个分子单糖的碳水化合物，是一种集保健、营养于一体的新型功能性糖源。低聚麦芽糖具有低糖度、低热量、低渗透压的特性，人体服用后可在肠道中持续水解，有延长人体供能、强化机体耐力和提高免疫力的功效，对因能源储备过量消耗而出现的血糖降低、体温升高、脑功能紊乱等一系列生理变化，具有良好的作用。所以低聚麦芽糖广泛应用于各种保健食品，如婴儿食品、保健品、饮料、冰淇淋、保健啤酒等，更是作为医药制剂、营养制品的添加剂而广泛应用。海藻糖是一种非还原性双糖，可以赋予生物抵抗干燥、寒冷、高温等恶劣环境的能力，且外源的海藻糖对生物大分子具有保护护用，这些生物特性使其在医药、食品、化妆品等方面具有广阔的应用前景。 耗材 Thermo Scientific TM Target2TM Nylon Syring Filters(0.45um， 30mm， P/N F2500-1) 一次性使用无菌注射器，1mL(上海治宇医疗器械有限公司) 由于海藻糖和低聚麦芽糖性质上的差异，在色谱柱上海藻糖保留很弱，低聚麦芽糖需要加入强洗脱剂醋酸钠才可以洗脱。实现两类化合物的快速有效的分离和检测，对糖类分析是个很大的挑战。本文采用离子色谱-脉冲安培法，建立了一种快速、高效的分离海藻糖、异麦芽糖及低聚麦芽糖的方法。 ( 去离子水(18. 2 MQ-cm， Therm o ScientificTM genPure ProTMUV-TOC， P/N 50131948) ) NaOH溶液(50%w/w水溶液， Alfa Aesar ) 仪器 ( Thermo Scientifi c TM Dion e xTM ICS-离子色谱系统， 包括： ) NaAc ( for molecular biology， anhydrous， BioUltra，Sigma Life Science) - ICS-3000 DP色谱泵 ( 叠氮化钠、海藻糖、异麦芽糖、异麦芽三糖、异麦 芽四糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖和 潘糖(国药集团化学试剂有限公司) ) ( - ICS-3000 DC检测器(含Thermo Scientific TMDionex TM IC CubeTM 谱立方和高压脱气装置) ) ( Thermo ScientificTM Dionex TM AS-AP自动进样器 ) Thermo ScientificTM Dionex TM ChromeleonTM 色谱 ( 工作站 ) 准确称取10mg海藻糖、异麦芽糖、异麦芽三糖、异麦芽四糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、潘糖(精确到0.001g)对照品，分别溶解于10mL叠氮化钠溶液(20mg/L)中，配制成1.000g/L的标准品储备液。 取上述标准品储备液配制成含100 mg/L的混合标准溶液。 取适量混合标准溶液(100mg/L)，以叠氮化钠溶液(20mg/L)逐级稀释成浓度为0.05、0.1、0.2、0.6、1、2、10和20mg/L的标准工作溶液。 称取待测样品10mg，叠氮化钠溶液(20mg/L)，制成样品储备液。 将样品储备液稀释20倍，尼龙膜过滤后，进样检测。 分析柱： Thermo Scientific Dionex CarboPac PA10，4x250mm (P/N 060142) 淋洗液：18.2MQ去离子水、250mmol/L NaOH 和500mmol/L NaAc 时间(min) A% 水 B% 250 mmol/L NaOH C% 500 mmol/L NaAc 0 87 12 1 2 83.4 15.6 1 20 49 36 15 30 70 10 30 30.1 0 0 100 33 0 0 100 33.1 19 80 1 37 19 80 1 37.1 87 12 1 42 87 12 1 进样体积：10pL； 柱温：30℃； 检测器：电化学检测，金电极，标准糖电位； 运行时间： 42 min 糖类化合物在强碱性条件下，结构中的羟基等电化学活性基团可以在金电极表面被氧化而导致电流变化，因此可通过脉冲安培检测器进行检测。实验发现，当流动相中仅有氢氧化钠时，低聚异麦芽糖的保留较强，需要在流动相中增加醋酸钠梯度才能将麦芽低聚糖依次洗脱，但会在色谱图中出现明显的醋酸钠梯度峰，且该梯度峰会干扰异麦芽三糖的出峰。因此将流动相初始条件中加入1%的醋酸钠，这样既可以保证海藻糖的保留，又可以将梯度变化的影响减弱，并且各低聚麦芽糖能够很好的分离。优化后的结果如色谱图1所示。 图1.混合标准溶液(6mg/L)与水溶剂对比谱图 线性、相关系数、检测限及重复性 将不同浓度的标准工作曲线溶液依次测定，取其峰面积值，以峰面积为纵坐标，标准溶液质量浓度为横坐标建立标准工作曲线，得到各化合物的线性回归方程和相关系数，如表1所示。以信噪比S/N=10计算方法的定量限，结果见表1。 表1.海藻糖、异麦芽糖和低聚麦芽糖线性数据、线性范围和定量限 Peak Name 线性范围 mg/L 相关系数 R² 截距 斜率 定量限(S/N=10)mg/L 海藻糖 0.05-10 0.9999 -0.0002 0.7174 0.05 异麦芽糖 0.2-20 0.9999 -0.0510 0.8021 0.17 异麦芽三糖 0.1-20 0.9999 -0.0082 0.7635 0.1 异麦芽四糖 0.1-20 0.9999 0.0065 0.8368 0.1 潘糖 0.2-20 0.9999 -0.0173 0.6362 0.15 麦芽三糖 0.1-20 0.9998 0.0008 1.3744 0.1 麦芽四糖 0.2-20 0.9993 0.1333 0.3214 0.15 麦芽五糖 0.05-20 0.9992 0.1219 0.5284 0.05 麦芽六糖 0.6-20 0.9992 -0.0613 0.3196 0.25 取1mg/L标准混合溶液，连续进样7次，考察方法的重复性(见图2)，7针重复进样RSD<1.01%，数据见表2. 样品检测及加标回收 称取待测样品10mg， 溶解于10mL 叠氮化钠溶液中(20mg/L)，制成样品储备液。 将样品储备液稀释20倍，进样检测。样品1和2测试结果见表3。 对1号样品进行加标回收测试，分别加入1.6mg/L、2mg/L和2.4mg/L标准混合溶液，考察回收率。结果见表4. 图2.1mg/L标准混合溶液重复性(进样7针) 表2.重复性(1mg/L标准混合溶液7针重复性) 峰面积% 保留时间% 海藻糖 0.75 0.19 异麦芽糖 0.96 0.37 异麦芽三糖 0.53 0.16 异麦芽四糖 1.01 0.10 潘糖 0.66 0.08 麦芽三糖 0.31 0.07 麦芽四糖 0.80 0.07 麦芽五糖 0.63 0.03 麦芽六糖 0.66 0.02 表3样品测试结果 1号样品 2号样品 检测值mg/L 样品含量mg/g 检测值mg/L 样品含量mg/g 海藻糖 ND - ND - 异麦芽糖 8.612 172.24 7.763 155.26 异麦芽三糖 3.134 62.68 2.850 57.00 异麦芽四糖 0.381 7.61 0.261 5.22 潘糖 4.548 90.96 4.434 88.69 麦芽三糖 0.251 5.01 0.374 7.48 麦芽四糖 ND

确定