二乙酰鸟嘌呤中二乙酰鸟嘌呤检测方案(液相色谱仪)

Excellence in Science Nexera UC 系统在原料药杂质分析中的应用 摘要：本实验使用岛津 Nexera UC SFC-UV 系统对原料药二乙酰鸟嘌呤及杂质进行分离，通过考察多种色谱柱和流动相组合， DAICEL DCpak SFC-A 和乙醇为流动相时可获得主药和杂质的最佳分离效果。在此基础上建立杂质 SFC分析方法，结果显示杂质在50~500 mg/L线性良好，保留时间和峰面积重复性 RSD 在 0.2%和1.5%以内。 关键词： Nexera UC SFC 药物杂质 超临界流体色谱 (Supercritical Fluid Chromatography， SFC) 是以超临界流体为主要流动相，添加改性剂或微量添加剂的二元或三元流动相的新型色谱分离技术。超临界 CO2(scCO2)以其安全、价廉、无毒、易制得、化学惰性等因素成为 SFC 常用的主要流动相。超临界流体具有低黏度、高扩散性和高溶解性等特点，使得 SFC 分析具有快速、高效、高分离等优势。 本实验使用的岛津 Nexera UC SFC-UV系统属于岛津最新的超临界流体色谱仪系列产品，具有系统耐压高、背压阀(BPR) 内部体积小、灵敏度高、操作界面通用性好等特点。本实验对原料药二乙酰鸟嘌呤及杂质进行分离，通过考察多种色谱柱和流动相组合获得最优分析条件，并建立杂质 SFC分析方法，结果显示线性和重复性等表现良好，可为进一步开展该类药物定性定量研究提供分离方法的参考。 《中国药典(2015版)》首次收载超临界流体色谱法(四部0531法)作为药物分析的可选方法，岛津 NexeraUC 系统可为相关药物的 SFC分析方法建立提供帮助。 实验条件 仪器 Nexera UC SFC-UV系统 具体配置为： LC-30ADsF (CO2输液泵)， LC-20ADXR(输液泵，含LPGU 低压梯度比例阀)，DGU-20A5(在线脱气机)， SIL-30AC(自动进样器)， CTO-20AC(柱温箱)， SFC-30A(背压调节单元)， SPD-20A(紫外检测器)， CBM-20A(系统控制器)， LabSolutions Ver 5.8(色谱工作站)。 样品信息 二乙酰鸟嘌呤是重要的医药中间体，杂质检测是其质量控制的关键。该化合物在常用溶剂中溶解性差，并且遇水分解，使得常规的 RP-HPLC 分析不能实现。本实验中以少量 DMSO溶解该样品后再以DMSO-ACN (1：1，v/v)稀释，经过滤后进样分析。 表1化合物信息 # 化合物中文名 化合物英文名 CAS# 分子式 1 乙酰基鸟嘌呤 N2-Acetylguanine 19962-37-9 C7H7N5O2 2 二乙酰鸟嘌呤 N(2)，9-Diacetylguanine 3056-33-5 C9H9N5O3 结果与讨论 图1甲醇为改性剂时不同色谱柱分离效果对比(检测波长：264nm) 1.ODS-P， 2.ODS-4， 3.OD-H， 4.SIL， 5.SFC-A 色谱柱填料对分离的影响 实验考察了 GL science ODS-P、ODS-4、SIL 及 Daisel 的 OD-H 和 SFC-A 五款色谱柱，所用规格均为4.6 mm I.D.x250 mm L.， 5 um。在 scCO2-MeOH体系中对样品进行分析，结果显示 ODS-P、ODS-4和 SIL 对样品中主成分和杂质分离度不佳， OD-H， SFC-A对该样品中两种成分的分离效果较前三款色谱柱好，如图1所示。对比 OD-H， SFC-A发现， SFC-A 虽然对主成分前的杂质峰形表现较差，但对该杂质的响应优于其在 OD-H色谱柱上的表现。 图2甲醇和乙醇作为改性剂时分离效果对比(检测波长：264nm)1.OD-H-甲醇，2.OD-H-乙醇，3.SFC-A-甲醇， 4.SFC-A-乙醇 流动相对分离的影响 SFC 分析中， scCO2和少量改性剂构成的混合流体对化合物的色谱保留行为具有显著影响，因此在色谱柱筛选的基础上对流动相进行优化，分别选择 scCO2-MeOH 和 scCO2-EtOH在OD-H 和 SFC-A 色谱柱上进行分析。结果显示在 SFC-A 色谱柱上以 scCO2-EtOH 进行分离时，无论是分离度还是杂质响应均为最佳，因此选择该条件为二乙酰鸟嘌呤样品的分析条件。 超临界流体色谱中，分离系统背压和柱温通常也是考察的关键。增高背压和提高温度可以改变超临界体的密度和粘度，进而改变洗脱能力和洗脱效果。本实验中，背压和柱温对实验结果影响并不显著，故在此未列出。 SFC 色谱条件 色 谱 柱 ： DAICEL DCpak SFC-A 4.6 mm I.D.x250 mm L.， 5 um 洗 脱 方 ：梯度洗脱，起始比例5%B，时间程序见表2所示 流动相： A-scCO2； B-乙醇流速：3mL/min柱温： 40℃检测波长：264nm背压：10MPa进样量：1pL式 表2梯度时间程序 Time Module Command Value Pump Pump B Con. 12 6 Pump Pump B Con. 25 8 Pump Pump B Con. 25 8 Pump Pump B Con. 5 10 Controller Stop 图3杂质单乙酰鸟嘌呤(50mg/L)重复性分析色谱图(n=6) 表3单乙酰鸟嘌呤(50mg/L) 重复性分析结果(n=6) 保留时间(min) 峰面积 1 5.135 34，567 2 5.132 33，970 3 5.134 34，476 4 5.128 34，480 5 5.137 33，973 6 5.121 35，047 平均值 5.131 34，419 RSD% 0.11 1.18 图4单乙酰鸟嘌呤标准曲线及参数 图5二乙酰鸟嘌呤样品分析结果 结论 本文使用岛津 Nexera UC SFC-UV 系统对药物中间体二乙酰鸟嘌呤中的杂质进行分析，有效避免使用反相色谱分析中该药物不稳定遇水分解的可能，并且 SFC 系统分析速度快、重现性好、灵敏度高、溶剂消耗少并且安全环保，另外使用 scCO2、甲醇、乙醇、乙腈等做流动相时和质谱联用也不存在任何障碍，方便 SFC 方法直接移植成为 SFC-MS 方法， 可进一步提升检测灵敏度和扩展应用领域。 岛津企业管理(中国)有限公司岛津(香港)有限公司 ( 免责声明： ) ( *本资料未经许可不得擅自修改、转载、 销 售； )