蜂蜜中氨基糖苷类抗生素检测方案(液质联用仪)

3 使用在线萃取LC-MS/MS技术筛查蜂蜜中的多类抗生素 Catherine Lafontaine， Yang Shi， Francois A. Espourteille， Thermo Fisher Scientific， Franklin， MA， USA Aria TLX-1系统； TSQ Quantum Ultra； 食品检测； TurboFlow技术 前言 在蜂箱中常使用抗生素来防止蜜蜂感染细菌性疾病。抗生素的使用必须很谨慎，以防止其在食用蜂蜜中长期残留。如果蜂蜜中抗生素的残留量大，会引起过敏反应和细菌的耐药性。 目前许多国家对蜂蜜中的抗生素残留进行了检测。LC-MS/MS是目前定量检测蜂蜜中抗生素残留的常用方法。但采用LC-MS/MS进行检测时，样品制备往往耗时长，操作繁琐，常常包括调节pH值、水解、液液萃取、固相萃取、溶剂蒸发和预浓缩等步骤。本文建立了一种在线液相色谱(LC)方法，运用具有ThermoScientific TurboFlow技术的Thermo Scientific Aria TLX系统，，对几类抗生素进行快速和全面的筛查。 目标 建立一个广泛适用的、自动化的LC-MS/MS方法，筛查蜂蜜中多类抗生素。 实验 方法信息 用含乙二胺四乙酸(EDTA)的缓冲溶液提取野花蜜中残留的几类典型的抗生素(大环内酯类，磺胺类，氨基糖苷类和四环素)。将两根TurboFlow柱(混合型阴离子交换柱和极性聚合柱)串联，采用TurboFlowTM方法对提取液进行净化。在上样过程中，待分析的抗生素被保留在萃取柱上，而简单的糖类不被保留，直接排到废液中。然后，待测抗生素被有机溶剂洗脱至封端的硅胶基质混合型反相分析柱(Thermo Scientific BETASIL Phenyl/Hexyl)内，再经梯度洗脱进入Thermo Scientific TSQ Quantum Ultra三重四极杆质谱仪，采用加热电喷雾电离(H-ESI)和正离子选择性反应监测(SRM)模式检测。整个LC-MS/MS方法运行时间少于18分钟。正离子选择性反应监测(SRM)参数和其他质谱参数见表1。 样品制备 本实验以野花蜜为检测样品，使用Mcllvaine/0.1MEDTA缓冲溶液对样品进行1：1w：v(克重蜂蜜：毫升体积缓冲溶液)的稀释1。用3：1的甲醇：水溶液配制磺胺吡啶、磺安噻唑、替米考星、泰乐菌素、土霉素和红霉素的储备液，浓度为100pg/ml。另外，配制浓度为100pg/ml的多西环素、去甲金霉素，链霉素和双氢链霉素的水溶液。将这些储备液均加入到1：1比例蜂蜜：缓冲溶液的样品中，作为加标液来配制一系列标准溶液和质量控制样品(QCs)。所有空白、标准溶液和质量控制样品的配制和分析均使用聚丙烯样品瓶。进样体积为0.050mL。 AriaTM TLX-1： TurboFlow 方法参数 TurboFlow Cyclone MAX 和 TurboFlow Cyclone-P 柱(0.5x50mm)，串联 BETASIL Phenyl/Hexyl柱， 100x3mm， 3 pm Aria操作系统软件1.6.2版 上样流动相参数流动相A：水，含1.0%甲酸流动相B：乙乙，含1.0%甲酸流动相C：10mM乙酸铵的水溶液， pH=9流动相D：甲醇，含10mM乙酸铵和1.0%甲酸 洗脱流动相 流动相A：水，含1mM NFPA*、0.5%甲酸和0.04% TFA**流动相B： 1：1甲醇：乙腈，含0.5%甲酸和0.04% TFA *NFPA九氟戊酸 **TFA三氟乙酸 离子极性 正离子 离子源 H-ESI 喷雾电压 4000 V 汽化室温度 400°C 毛细管温度 370°C 鞘气(N，)压力 30 arb units 辅助气体(N，)压力 60 arb units 离子吹扫气体(N，)压力 0.0 arb units 截取锥偏压 5V(链霉素) 5V(其他抗生素) 碰撞压力 1.2 mTorr 色谱过滤器峰宽 8.0 s 扫描模式 SRM 扫描时间 0.020 s 扫描宽度 0.100 m/z Q1 Da.峰宽(FWHM) 0.700 Q3Da.峰宽(FWHM) 0.700 结果与讨论 Thermo Scientific LCQUAN 2.5.6版数据定量处理软件将分析结果打包输出，并将市售蜂蜜内少量内源型分析物作为背景值进行扣除。图1为1：1蜂蜂/缓冲溶液中浓度为100ng/ml的10种待测抗生素的色普图。通过基体匹配校正得出了所有分析物的线性范围达两个数量级(r²>0.99)(见表2)。所有分析物的定量下限的CV(n=3)值均小于19%，其它曲线点的CV(n=3)值均小于8%。以土霉素为例，图2为LCQUANTM软件绘制的线性回归曲线。对4个QC样品(浓度为2、50、100和500ng/mL)均平行处理和测定3次，考察QC样品的变异性。所有分析物的RSDs值均小于7%(除开红霉素小于15%)。当QC样品中待测抗生素的浓度低于其定量下限时，得出的测定结果不被采用。 图1：1：1蜂蜜/缓冲溶液中浓度为100ng/ml的标准色谱图 图2LCQUANTM软件绘制的土霉素校准曲线、定量下限(左窗口)以及定量上限色谱图(右窗口)。 16.80 8.95 0.9988 50-500 10.0 5.46 多西环素 0.9990 10-500 5.0 10.80 11.70 *基于8个点的标准曲线(ng/mL)： 0.500，2.00， 5.00，10.0，50.0，100，200，500。 **残留浓度水平在线性范围内(20%或更低)。 结论 ( 在蜂蜜质量监测过程中，对于不同类别的大量抗生素的检测一直是很困难的，常需要采用多重LC-MS方法进行行测。在本实验中，首次应用了两根具有不同化学填料的在线TurboFlow萃取柱。结果显示，该方法的设计能够实现复杂的蜂蜜基体中所有典型抗生素的分离和定量检测。仅需加入缓冲溶液以减少样品粘度，缩短了样品处理的时间。具有了这些特性，应用该方法能够迅速地对一个已知样品中的抗生素残留进行大范围筛查，从而提高样品检测通量。 此外，该方法结合了Aria TLX-4系统，进 一步 将LC-MS/MS的 总运行时间 缩 短至原来的1/4，每小时能够筛查12个样品。今后可能会对抗生素和环境污染物进行更大范围的筛查，同时降低所有分析物的检出限，从而在实现筛查的同时， ) 还能够准确定量。 上海 北京 服务热线 ( 上海浦东 新金桥路27号6号楼 邮编：2 0 1206 ) 北京东城区安定门东大街28号 800 8105118 雍和大厦西楼F座7层 4006505118 邮编：100007 电话：021-68654588 电话：010-84193588 传真：021-64457830 传真：010-66210845 S CIENTIFIC 广州广州市东风中路时代地产中心邮编：话：真：hermoS CIENTIFI CPart of Thermo Fisher Scientificanalyze.cn@thermofisher.comwww.thermo.com.cn 在蜂蜜质量监测过程中，对于不同类别的大量抗生素的检测一直是很困难的，常需要采用多重LC-MS方法进行检测。在本实验中，首次应用了两根具有不同化学填料的在线TurboFlow萃取柱。结果显示，该方法的设计能够实现复杂的蜂蜜基体中所有典型抗生素的分离和定量检测。仅需加入缓冲溶液以减少样品粘度，缩短了样品处理的时间。具有了这些特性，应用该方法能够迅速地对一个已知样品中的抗生素残留进行大范围筛查，从而提高样品检测通量。此外，该方法结合了Aria TLX-4系统，进一步将LC-MS/MS的总运行时间缩短至原来的1/4，每小时能够筛查12个样品。今后可能会对抗生素和环境污染物进行更大范围的筛查，同时降低所有分析物的检出限，从而在实现筛查的同时，还能够准确定量。