化妆品,个人护理产品,消费品中N-亚硝基二丁胺检测方案(液相色谱仪)

「应用纪要]THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 「应用纪要1 ■ Waters 快速、高效地测定化妆品、个人护理产品和消费品中亚硝胺的方法 Michael Jones 和 Christopher Glover² 1沃特世公司(英国曼彻斯特) 应用优势 本应用纪要介绍了一种用于鉴定和定量消费品中的致癌性亚硝胺的方法，该方法具有以下优势： 通过缩短运行时间提高样品通量和减少溶剂用量。 单一、直接的LC-MS方法，可分析非挥发性和挥发性亚硝胺，且无需进行衍生化。 可定量分析浓度在法规限值50 ug/kg以下的N-亚硝胺。 可利用RADARTM数据采集软件挖掘出更多的未知物。 沃特世解决方案 ACQUITY UPLC@I-Class系统 ACQUITY UPLC HSST3色谱柱 XevoTQ-S micro MassLynx@MS软件 Oasis@ HLB SPE小柱 关键词 亚硝胺，个人护理产品，，化妆品，消费品，受管制物质， RADAR， PICS 简介 N-亚硝胺是一类已知对动物模型具有致癌和致突变作用的化合物，能够通过多种暴露途径作用于多个不同的组织位点1-3。无论是在制造过程还是产品储存过程中，消费品、化妆品和个人护理产品配方中都有可能会形成亚硝胺。如果产品中除了硝化剂(例如亚硝酸、亚硝酸盐或氮氧化物)之外还存在仲胺，就会形成N-亚硝胺(一般在酸性条件下)。化妆品、个人护理产品和消费品中亚硝胺含量的分析应当被纳入产品安全性评估流程，以确保符合新的《化妆品和消费品法规》5。此外还有研究表明，存放超过五年的化妆品与同种产品的新鲜样品相比，其N-亚硝胺浓度更高6。这说明N-亚硝胺的形成是化妆品保质期的限制因素，我们应对其进行评估并将其纳入化化品的常规安全性评估中。 在美国和欧盟，消费品制造商在产品商业化之前必须确保产品的安全性，在产品标签上列出所有成分并遵守有关成分和产品的所有既有限制条款。产品的任何潜在风险都会作为安全性评估的一部分进行评价。在欧盟，2013年生效欧盟指令1223/20095提高了对化妆品安全性的要求，并且为该领域的所有分析人员简化了分析方案。它提供了稳定且受到国际认可的分析方案，在加强产品安全的同时还考虑到了最新的技术进展。EU 1223/2009的附件Ⅱ和附件Ⅲ规定，化妆品中N-亚硝胺(及其它污染物)的浓度不得超过50 ug/kg。在美国， 《食品、药品和化妆品法案》(1938)和《公平包装与标签法》(1966)规定，任何含有N-亚硝胺的化妆品均被视作搀假产品，因此美国FDA有权据此查封和清除市场上的此类产品78。在亚洲，东盟国家效仿上述欧盟法规制定了《东盟化妆品指令》9。中国、印度和日本也通过相同的方式监管化妆品。 欧盟指令2009/48/EC涉及可能被放入儿童口中的玩具、指画颜料和弹性体材材的安全性10。该指令还规定，N-亚硝胺的累积总量不得超过50 ug/kg。该法规适用于任何包含弹性体材料的玩具或设备，例如儿童安抚奶嘴和奶瓶奶嘴。采用此方法分析婴儿奶瓶奶嘴中的N-亚硝胺时的适用性也采用欧盟标准草案prEN 71-12：2012：E中的样品制备方案进行了测试。过去，用于分析化妆品配方和弹性体材料中N-亚硝亚的方法包括GC-TEA、GC-MS、HPLC与比色检测器联用的方法以及LC-ESI-MS11-15。LC方法的运行时间为12~35 min， 而GC方法的运行时间为20~40 min。据报道，TEA分析非常耗时，因此样品通量非常有限。此外，T它通常只适用于分析挥发性亚硝胺。 本应用纪要介绍了采用Waters@ ACQUITY UPLC I-Class系统与Xevo TQ-S micro联用的方法对此前曾在化妆品和个人护理产品配方中检出的8种挥发性及非挥发性N-亚硝胺进行的分析。与与前的方法相比，该方法具有若干优点，例如选择性和灵敏度均优于比色法和ESI-MS方法等等。此方法能够定量分析浓度在法规限值50 ug/kg以下的亚硝胺。其运行时间比HPLC和GC方法更短，有效节省了时间和成本。此方法采用RADAR数据采集方法，能够同时挖掘采集到全扫描数据，从而搜索其它污染物。 实验 采用Qiang等人"开发和验证的提取方案制备化妆品和个人护理产品样品以待分析。对样品进行超声提取处理之后，使用Oasis HLB SPE小柱净化样品。使用甲醇：丙酮(1：1)作为超声提取介质制备液体和凝胶样品。使用乙醇：丙酮(4：1)制备固体或半固体化妆品样品。 超声提取方案 借助涡旋混合，将1g个人护理产品样品溶解于5.0mL适用的提取介质中，然后超声处理30 min。 所得的提取混合液以6000 rcf离心15 min。 在40℃的恒定氮气流中将2mL上清液挥干，然后将其复溶于2 mL30%甲醇水溶液中以备固相萃取处理。 SPE方案 向含有200mg吸附剂的6 cc³0asis HLB SPE小柱(部件号WAT106202)中灌注6mL甲醇，然后灌注6 mL超纯水。 将样品加载到SPE小柱中，用3mL30%甲醇水溶液进行清洗。然后用6 mL MeOH从小柱中萃取出样品。 在N2下挥干样品，将其复溶于1 mL 2.5%甲醇水溶液中，然后使用0.2 um的滤膜过滤，以备进样。 LC条件 LC系统： ACQUITY UPLCI-Class 运行时间： 9.1 min 色谱柱： ACQUITY UPLC HSS T3 1.7 um， 2.1x100 mm 柱温： 40℃ 样品温度： 5℃ 流动相A： 水(含0.1%甲酸) 流动相B： 甲醇(含0.1%甲酸) 流速： 0.3 mL/min 进样体积： 20pl 流动相梯度详见表1。 时间 流速 (mL/min) %A %B 曲线 (min) 1 初始 0.30 97.5 2.5 一 2 1.0 0.30 97.5 2.5 6 3 2.0 0.30 50.0 50.0 6 4 3.0 0.30 50.0 50.0 6 5 3.5 0.30 2.5 97.5 6 6 6.0 0.30 2.5 97.5 6 7 6.1 0.30 97.5 2.5 6 表1.ACQUITY I-Class的流动相梯度。 MS条件 MS系统： Xevo TQ S-micro 电离模式： APCI正离子模式 电晕针电压： 15V 离子源温度： 150℃ 探头温度： 600℃ 脱溶剂气流速： 1200L/h 锥孔气流速： 200 L/h 采集模式： 配备RADAR的MRM 使用MassLynx软件的IntelliStart“功能自动优化电离参数和离子对。IntelliStart是MassLynx的功能之一，能够提升易操作性并减少用户之间的差异，可用于监控系统健康状态、执行QC检查和协助方法开发。在本例中，我们利用IntelliStart的自动参数调谐功能来确定最优电离参数，例如施加于母离子的锥孔电压和MRM通道的碰撞气体能量等。表2汇总了所测分析物的最优参数，同时给出了有关分析物名称、化学式和CAS号的信息。 名称，化学式，CAS号 结构 保留时间 (min) 锥孔电压 (V) 通道 碰撞能量 n=0 N、 N-亚硝基二甲胺， C，HN，0，62-75-9 2.1 30 75.0→58.0* 13 N-亚硝基二乙胺， N=O 3.1 24 103.1→47.0 15 CH2N，0，55-18-5 103.1→75.0* 9 N-亚硝基二丙胺， 0 131.1→43.1 11 C，HN，0，621-64-7 4.2 26 131.1→89.1* 8 N-亚硝基二乙醇胺， N=O 1.4 10 135.0→74.0 8 CHINO，1116-54-7 HO' OH 35.0→104.0* 4 N-亚硝基二丁胺， N=O 4.5 26 159.1→57.1* 12 CHN，0，924-16-3 159.1→103.0 9 N-亚硝基吡咯烷， N 2.8 44 101.0→40.5 19 CHN，0，930-55-2 101.0→55.0* 13 N-亚硝基哌啶， 3.2 36 115.1→40.9 25 C.HN，0，100-75-4 115.1→69.1* 17 N-亚硝基吗啉， NO 2.6 28 117.0→45.0* 13 CHNO，，59-89-2 o 117.0→85.9 9 表2.此前曾在消费品配方中检出的脂肪族、环状和杂环N-亚硝胺、其结构、相关CAS号和经验化学式、预期保留时间、锥孔电压、MRM通道以及相关的碰撞能量值。 *表示定量通道。 仪器控制、数据采集和结果处理 利用MassLynx软件控制ACQUITY UPLCI-Class系统和Xevo TQS-micro， 并进行数据采集。使用TargetLynx"应用软件执行数据定量分析。 结果与讨论 将MRM模式的Xevo TQ S-micro(APCI正离子电离模式)与ACQUITY I-Class系统联用，分析此前曾在化妆品配方中检出的8种N-亚硝胺。 如前所述，使用MassLynx软件的IntelliStart功能优化各分析物的MRM通道。LC条件(色谱柱填料、梯度设置、进样体积等)基于Al-Kaseem等人此前的研究16并经过了优化，以改善运行时间、洗脱顺序和信号强度。 图1所示为标准品的示例色谱图，标准品采用化妆品基质制备，其中的目标分析物含量相当于法规限值50 ug/kg。 图1.本研究分析的8种N-亚硝胺的基质加标标准品(加标浓度为法规限值50 ug/kg)的示例色谱图。 为所有被测化合物制备0.001ppm至0.5ppm的混合校准标准品并进行分析。结果表明，所有亚硝胺在0.01 ppm至0.5 ppm(法规限值0.05 ppm的10倍)的浓度范围内均呈线性响应。所有曲线的R2值均大于0.99，且基质效应小于8%。 化妆品和个人护理产品样品的分析 采用各种化妆品和个人护理产品(包括洗发水、洗手液和口红)制备样品。采用实验部分详述的方法测试所有样品中是否含有N-亚硝胺，结果发现样品中均不含N-亚硝胺。为了测试方法的适用性，将浓度为规定限值(或近似值)的亚硝胺加标至空白基基样品中。在下面图2所示的示例中，洗发水样品在制备完成后加标浓度为0.06 ppm(ng/mL)的N-亚硝基二丙胺。经超声萃取和SPE后，使用TargetLynx方法对样品与基质品准品进行分析以测定N-亚硝基二丙胺浓度。 使用TargetLynx方法对数据进行定量分析以测定加标样品中N-亚硝基二丙胺的含量。图1展示了TargetLynx中生成的加标洗发水样品的结果，以及用于加标样品定量分析的基质标准品的校准曲线。图1还展示了N-亚硝基二丙胺用于确证的MRM通道。经过计算，该方法得到所有加标样品结果的准确度在待在配方(包括洗发水、洗手液和口红)预期结果的98%至102%范围内。 图2.加标有N-亚硝基二丙胺的洗发水样品的TargetLynx结果汇总。 婴儿奶瓶奶嘴的分析 根据欧盟标准prEN71-12：2012：E中制定的草案对购自一家领先制造商的无硅奶嘴进行检测。将构成奶嘴的10cm²弹性体材料浸没于含有亚硝酸盐的合成唾液中。研究证实，硝酸盐能够在酸性条件(例如人胃中)下将仲胺转化为N-亚硝胺17。将奶嘴样品浸泡30 min后根据方法对所得的上清液进行分析，无需进一步样品制备。 分析未掺杂的浸泡样品以确定其中是否存在亚硝胺。发现样品中含有痕量N-亚硝基二丁胺，其浓度为规定限值的1/10左右。为进一步测试该方法的有效性，制备更多奶嘴样品并加标浓度为规定限值1.4倍的N-亚硝基二乙醇胺。还向样品中加标三种不同N-亚硝胺的混合物，每种N-亚硝胺的浓度均低于规定限值，但累积浓度高于50 ug/kg的规定限值。图3展示了N-亚硝基二乙醇胺加标样品的TargetLynx结果汇总，包括进样的计算结果、加标样品的色谱图以及用于计算的N-亚硝基二乙醇胺校准曲线。 图3.NDELA加标的婴儿奶瓶奶嘴样品的TargetLynx结果汇总。 由NDELA加标样品和低浓度加标样品生成的TargetLynx样品定量分析报告如图4所示。 #Name Trace RT Area IS Area Response ng/mL 1 N-Nitrosodimethyl amine 75>58 2 N-Nitroso-diethylamine 103.1>75 3.09 576.317 576.317 0.018 3 N-Nitroso-dipropylamine 131.1>89.1 4.19 1685.821 1685.821 0.022 4 N-Nitroso-dibutylamine 159.1>57.1 4.54 2485.766 3012.368 2485.766 0.006 5N-Nitrosamine-Diethanolami... 135>104 1.41 288.337 288.337 0.070 6 N-Nitroso-morpholine 117>45 7 N-Nitroso-piperidine 115.1>69.1 3.21 938.489 938.489 0.017 8N-Nitroso-pyrollidine 101.1>55 图4. TargetLynx汇总报告详细列出了婴儿奶瓶奶嘴中存在的N-亚硝胺。 过期消费品样品的RADAR分析 如前所述，研究人员已注意到个人护理产品配方中的N-亚硝胺浓度可能会在储存过程中升高6。测定随时间推移而产生的所有N-亚硝胺有助于制造商确定其产品的安全保质期。 为此，利用本文方法检测全新口红配方和同一品牌的旧样品中亚硝胺的存在情况。除该方法中概述的对八种亚硝胺的目标搜索外，利用Xevo TQ-S micro仪器的RADAR功能可同时记录多个MRM通道并扫描指定m/z范围内的实验结果。图5展示了新口红样品和过期口红样品TIC色谱图的对比。TIC中保留时间约4.55分钟处的额外色谱峰不对应于任何N-亚硝基二丁胺，因为该化合物MRM通道色谱图的4.55分钟处没有任何峰。 图5.全新口红配方和过期口红配方样品的TIC色谱图以及N-亚硝基二丁胺的MRM通道色谱图，表明过期样品中不含这种化合物。 在使用RADAR数据采集模式进行分析时可对预期分析物进行准确定量，，同时可研究样品中存在的未知物，数据完整性无任何损失。图6同样展示了新口红样品和过期口红样品TIC色谱图。在RADAR模式下运行时，所采集的数据可用于分析相关质谱图以确定峰保留时间观测值处的任何差异。图6中的放大质谱图展示了与新样品质谱图相比，过期样品m/z199处明显存在一种离子。提取该离子得到图6所示的提取离子色谱图，该离子色谱峰对应的保留时间为4.55分钟。文献检索结果表明，如果过期样品因形成N-亚硝胺而出现色谱峰，则m/z199可能对应于亚硝基二苯胺的[M+H]+离子。在后续研究中，计划利用高分辨率质谱(HRMS)确认过期口红样品中存在的未知离子归属。 图6.使用RADAR数据采集研究存在的未知物：A.全新口红样品的TIC以及4.5至4.55 min的平均质谱图；B.过期口红样品的TIC以及4.5至4.55min的平均质谱图；C.过期口红样品质谱图中m/z 199处离子的XIC。 结论 本文开发出一种快速检测和定量分析消费品配方中八种常见亚硝胺的LC-APCI-MS方法。化妆品配方和塑性塑料玩具中浓度不超过规定限值50 ug/kg的所有分析物均可得到定量。本文对三种化妆品配方和一种弹性体材料中是否含有亚硝胺进行了测试。对洗发水和洗手液配方的测试结果表明其中不含亚硝胺。实验中发现所测试的婴儿奶瓶奶嘴中含有浓度低于规定限值的痕量N-亚硝胺。结合RADAR数据采集的方法能够挖掘全扫描质谱数据中可能存在的其他亚硝胺，结果表明过期化妆品配方中含有其他N-亚硝胺。 ( 参考文献 ) ( I . 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