高蛋白食品中人工合成色素的含量检测方案(液相色谱仪)

液相色谱法检测高蛋白食品中人工合成色素的含量 合成色素即人工合成的色素，其优点不少，如色泽鲜艳，着色力强，色调多样，但它有一个大缺点，即具毒性（包括毒性、致泻性和致癌性）。这些毒性源于合成色素中的砷、铅、铜、苯酚、苯胺、乙醚、氯化物和硫酸盐，它们对人体均可造成不同程度的危害。中国允许在食品中添加的合成色素共计28种，合成色素的分类如下所示： 有机合成色素：苋菜红、胭脂红、柠檬黄、新红、赤藓红、诱惑红、日落黄、亮蓝和靛蓝及其铝色淀，喹啉黄；无机合成色素：二氧化钛和合成氧化铁；天然等同合成色素：β-胡萝卜素，番茄红素；其他合成色素：叶绿素铜钠（钾）盐：叶绿素铜（钾）盐。     有机合成色素的铝色淀是通过纯有机合成燃料与氧化铝反应后，经清洗和干燥等工序，使水溶性色素沉淀在不溶性基质上所制备的特殊着色剂，其不溶于任何介质，通过扩散在某种载体中（如砂糖、油、甘油、糖浆）进行着色。     有机合成色素从结构上分为偶氮色素类（苋菜红、胭脂红、日落黄、柠檬黄等）和非偶氮色素类（赤藓红、亮蓝、靛蓝等）。这些色素的分子量在450-880之间，最大吸收波长在428-630nm之间。其耐氧化还原性能均较差；耐热、耐光性能稳定（靛蓝除外）；胭脂红、诱惑红、日落黄、靛蓝在碱性条件下不稳定，赤藓红、靛蓝在酸性条件下不稳定。     对食用合成色素的安全性存在争议主要集中在有机合成色素，有机合成色素可以改善商品外观并吸引消费者购买，于是有不法分子在利欲驱使下，突破允许使用品种、范围和数量，滥用、重剂量使用色素，更使食品安全面临挑战。许多合成色素有一定毒性，必须严格控制使用品种、范围和数量，限制每日允许摄入量(ADI)。有些色素长期低剂量摄入，也存在致畸、致癌的可能性。     仪器介绍     LC600B二元高压梯度液相色谱 (​http:​/​​/​www.kj17.com.cn​/​fenxiyiqi​/​yxspy.html" \t "http:​/​​/​www.kj17.com.cn​/​jishuzhichi​/​_blank​)系统（南京科捷分析仪器有限公司）配备高压梯度泵1台（内含2台恒流泵和1台梯度混合器），梯度混合器（专利）性能优越，16:9的TFT彩屏支持脱机时通过仪器触屏输入和显示所有信息。支持手动进样，可选配自动进样器，采用注射器定量，流动相过针，电脑控制进样量大小，无需更换定量环即可改变进样体积，极大的方便用户操作。     实验方法     样品处理：1.取样样品可食用部分提取前经匀浆处理；     2.提取准确称取样品5±0.005g于30mL离心管中，加入无水乙醇:氨水:水(7:2:1)溶液10mL混匀，超声10min，4000r/min离心10min，取上清液转移至新的离心管中，沉淀继续加入无水乙醇:氨水:水(7:2:1)溶液10mL、5mL提取两次；     3.冷冻除蛋白合并上清液，于低温冰箱中-42℃冷冻0.5、1、3、5、12h，快速取出于冷冻离心机5℃条件下8000rpm离心5min，取上清液；     4.浓缩除氨上清液转移至水浴锅中在接近沸腾的水中进行蒸发至8~12mL，取出冷却至室温，以0.1mol/L柠檬酸溶液调节pH至6~7，得到提取液的浓缩液；     5.净化聚酰胺小柱经6mL0.1mol/L柠檬酸溶液活化后，加入浓缩液，弃掉滤出液，以12mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH=4)洗涤小柱，分别以纯甲醇、无水乙醇:氨水:水(7:2:1)溶液和0.1mol/L的氢氧化钠洗脱，每种洗脱剂分别使用1、3、5mL进行优化，弃掉最初0.3mL流出液，收集剩余流出液并抽干小柱。流出液在50℃下氮气吹至0.8mL以下，加乙酸铵溶液至1mL，充分溶解残渣，样液经0.22μm水相微孔滤膜过滤，滤液供液相色谱测定。     色谱条件： 色谱柱 C18柱250mm×4.6mm，5μm 流动相 A：20mmol/L乙酸铵溶液，20mmol/L乙酸铵+0.1%氨水溶液和纯水； B：甲醇 梯度洗脱 1~4min，以10%比例的水相进行洗脱，4~10min，线性提高甲醇的比例至100%，10~13min，100%甲醇比例，13~16min进行清洗色谱柱并回至初始流动相比例 流速 1mL/min 柱温 30℃ 进样量 25μL 检测波长 赤藓红 靛蓝 苋菜红 诱惑红 胭脂红 日落红 柠檬黄 亮蓝 530 602 523 512 510 490 430 630     合成色素即人工合成的色素，其优点不少，如色泽鲜艳，着色力强，色调多样，但它有一个大缺点，即具毒性（包括毒性、致泻性和致癌性）。这些毒性源于合成色素中的砷、铅、铜、苯酚、苯胺、乙醚、氯化物和硫酸盐，它们对人体均可造成不同程度的危害。中国允许在食品中添加的合成色素共计28种，合成色素的分类如下所示：    有机合成色素：苋菜红、胭脂红、柠檬黄、新红、赤藓红、诱惑红、日落黄、亮蓝和靛蓝及其铝色淀，喹啉黄；无机合成色素：二氧化钛和合成氧化铁；天然等同合成色素：β-胡萝卜素，番茄红素；其他合成色素：叶绿素铜钠（钾）盐：叶绿素铜（钾）盐。有机合成色素的铝色淀是通过纯有机合成燃料与氧化铝反应后，经清洗和干燥等工序，使水溶性色素沉淀在不溶性基质上所制备的特殊着色剂，其不溶于任何介质，通过扩散在某种载体中（如砂糖、油、甘油、糖浆）进行着色。    有机合成色素从结构上分为偶氮色素类（苋菜红、胭脂红、日落黄、柠檬黄等）和非偶氮色素类（赤藓红、亮蓝、靛蓝等）。这些色素的分子量在450-880之间，最大吸收波长在428-630nm之间。其耐氧化还原性能均较差；耐热、耐光性能稳定（靛蓝除外）；胭脂红、诱惑红、日落黄、靛蓝在碱性条件下不稳定，赤藓红、靛蓝在酸性条件下不稳定。    对食用合成色素的安全性存在争议主要集中在有机合成色素，有机合成色素可以改善商品外观并吸引消费者购买，于是有不法分子在利欲驱使下，突破允许使用品种、范围和数量，滥用、重剂量使用色素，更使食品安全面临挑战。许多合成色素有一定毒性，必须严格控制使用品种、范围和数量，限制每日允许摄入量(ADI)。有些色素长期低剂量摄入，也存在致畸、致癌的可能性。    仪器介绍    LC600B二元高压梯度液相色谱系统（南京科捷分析仪器有限公司）配备高压梯度泵1台（内含2台恒流泵和1台梯度混合器），梯度混合器（专利）性能优越，16:9的TFT彩屏支持脱机时通过仪器触屏输入和显示所有信息。支持手动进样，可选配自动进样器，采用注射器定量，流动相过针，电脑控制进样量大小，无需更换定量环即可改变进样体积，极大的方便用户操作。    实验方法    样品处理：1.取样样品可食用部分提取前经匀浆处理；    2.提取准确称取样品5±0.005g于30mL离心管中，加入无水乙醇:氨水:水(7:2:1)溶液10mL混匀，超声10min，4000r/min离心10min，取上清液转移至新的离心管中，沉淀继续加入无水乙醇:氨水:水(7:2:1)溶液10mL、5mL提取两次；    3.冷冻除蛋白合并上清液，于低温冰箱中-42℃冷冻0.5、1、3、5、12h，快速取出于冷冻离心机5℃条件下8000rpm离心5min，取上清液；    4.浓缩除氨上清液转移至水浴锅中在接近沸腾的水中进行蒸发至8~12mL，取出冷却至室温，以0.1mol/L柠檬酸溶液调节pH至6~7，得到提取液的浓缩液；    5.净化聚酰胺小柱经6mL0.1mol/L柠檬酸溶液活化后，加入浓缩液，弃掉滤出液，以12mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH=4)洗涤小柱，分别以纯甲醇、无水乙醇:氨水:水(7:2:1)溶液和0.1mol/L的氢氧化钠洗脱，每种洗脱剂分别使用1、3、5mL进行优化，弃掉最初0.3mL流出液，收集剩余流出液并抽干小柱。流出液在50℃下氮气吹至0.8mL以下，加乙酸铵溶液至1mL，充分溶解残渣，样液经0.22μm水相微孔滤膜过滤，滤液供液相色谱测定。    色谱条件：色谱柱C18柱250mm×4.6mm，5μm流动相A：20mmol/L乙酸铵溶液，20mmol/L乙酸铵+0.1%氨水溶液和纯水；B：甲醇梯度洗脱1~4min，以10%比例的水相进行洗脱，4~10min，线性提高甲醇的比例至100%，10~13min，100%甲醇比例，13~16min进行清洗色谱柱并回至初始流动相比例流速1mL/min柱温30℃进样量25μL检测波长赤藓红靛蓝苋菜红诱惑红胭脂红日落红柠檬黄亮蓝530602523512510490430630