动物源食品中81种兽药残留检测方案(液相色谱仪)

应用文献Note：CM0075 Q-Exactive液相色谱-高分辨质谱联用同时检测动物源食品中81种兽药残留 刘鑫李建辉杜伟张朝晖 1(北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心食品实验室) 2(赛默飞世尔科技) 近年来，以瘦肉精为代表的兽药残留已逐渐成为人们普遍关注的-个社会热点问题。药物残留不仅可以直接对人体产生急慢性毒性作用，引起细菌耐药性的增加，还可以通过环境和食物链的作用间接对人体健康造成潜在危害。动物源食品中兽药残留的检测具有待测物质浓度低，样品基质复杂，干扰物质多、动物种类多样，对药物代谢存在差异等问题，一直以来是食品安全检测中的难点。因此为保证人们健康和食品安全，必须建立一套快速、有效、覆盖面广的动物源食品中兽药残留的筛查方法。 Q-Exactive是赛默飞世尔科技在2011年推出的新型四极杆和轨道阱杂交高分辨质谱仪，它将高选择性四极杆的离子过滤与Orbitrap高分辨准确质量数(HR/AM)测量技术相结合，在分辨率、扫描速度和灵敏度性能上进一步提升，并提供各种高分辨扫描功能，适应不同的应用需要。Q Exactive质谱仪能进行高通量的目标物或非目标物筛选，能够实现高可靠性的确证和定量分析， Q Exactive的高性能、稳定性和可操作性为前沿研究和常规检测提供更加可靠的分析结果。本文利用Q-Exactive液相色谱质谱联用系统，建立了动物源中多组分兽药残留同时筛查的快速分析方法 1实验部分 1.1仪器与试剂 Q-Exactive液相色谱质谱联用系统(美国ThermoFisher Scientific公司)； Hypersile Gold C18色谱柱(100mm x 2.1 mm， 1.9 um， 美国Thermo FisherScientific公司)，乙腈(色谱纯，美国ThermoFisher Scientific公司)；甲酸(色谱纯，美国Tedia公司)；乙酸铵(美国Thermo Fisher Scientific公司)；实验用水为去离子水。 1.2样品制备 动物组织样品先绞碎，均质。称取2.5g样品放入50mL离心管中，加入5g无水硫酸钠和10mL乙腈提取液，超声提取30分钟，8000转离心15分钟，取上清液氮气吹干，使用50%乙腈水溶液定容至1mL，待测。 1.3液相色谱条件 色谱柱： Hypersile Gold C18色谱柱， 100mm x2.1mm， 1.9um 流动相A：含5mM乙酸铵、0.1%甲酸的水溶液流动相B：乙腈 流速：-300 pL/min 梯度： 02681 55 柱温：30℃ 进样体积：：10pL 1.4.质谱条件 离子源： HESI-II 喷雾电压：3800V(正离子模式) 气化温度：300°C 鞘气压(N2)： 35 arb 辅助气压(N2)：10 arb 离子传输管管温度：320°C 质量范围： m/z 50-900 (R70000) 二级质谱：基于母离子列表的数据依赖采集(R17500) 2.1色谱图 取动物组织中常见的喹诺酮、磺胺、、β受体激动剂等81种兽药标准品，配制混合标样，在空白猪肉基质液中添加适当浓度混合标样，按上述实验条件进样10pL。图1为猪肉基质中加标500 ng/mL的部分兽药色谱图。 Time (min) Time (min) 图1猪肉基质中部分兽药Q Exactive色谱图 在空白猪肉基质液中分别加入混合标准样品，配置浓度为5ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL 和500 ng/mL的基质加标溶液，按上述方法进样10pL，在各组分精确质量提取色谱图上积分峰面积，外标 法制作校准曲线，权重取1/X，结果如表1所示，各组分线性关系良好，线性回归系数均在0.98以上。取10ng/mL基质加标液，重复进样5次，各组分重复性良好， RSD均在15%以内。 表1猪肉基质中81种兽药残留分析结果 (min) (r2) 5.51 1.14 0.70 Y=3.97233e+006+1.12926e+006*X0.9889 8.74 1.37 Y=-305984+61882.5*X Y=1.72733e+006+1.11977e+006*X0.9895 8.53 cimaterol 1.37 0.74 Y=463305+662920*X 0.9916 10.9 metronidazole clopidol 1.37 0.95 Y=-82189.3+540348*X 0.9978 9.76 1.41 Y=8.81634e+006+3.14453e+006*X Y=748865+761256*X 0.9972 11.3 1.48 Y=3.46635e+006+2.83833e+006*X 0.9935 corbadox 1.62 Y=8.50654e+006+1.64441e+006*X Y=1.25932e+007+4.42528e+006*X 1.64 1.67 1.83 1.83 Y=414674+2.473e+006*X 0.9934 1.86 1.97 Y=9.96558e+006+4.4951e+006*X 0.9937 1.98 0.9980 oxytetracycline Y=-594933+325824*X fleroxacin Y=16347.3+565366*X 0.9953 Y=66080+1.11746e+006*X ofloxacin 2.02 实际样品分析中各组分阳性样品的确认，在Thermo公司的高分辨筛查软件Exactfinder的辅助下完成。Exactfinder是一.款基于高分辨色谱质谱联用的数据处理辅助软件，用于多组分同时筛查及完全未知物的定性定量分析。对化合物的定性确认，除了精确质量数外，Exactfinder还提供保留时间、同位素分布、主要二级碎片确认和二级质谱图相识度比对等多种方法，综合判断，以得到准确度定性结果，避免假阳性检测 Q-Exactive能够得到化合物准确的同位素峰形，可以用来作定性确认。图2为基质加标样品中氯丙嗪的同位素分布确认结果，右上图为氯丙嗪标准的同位素分布图，右下图为实际样品质谱图中氯丙嗪同位素分布情况，i可见各同位素峰无论在精确质量上还是在强度分布上基本一致，可以确认检测结果的可靠性。 图2氯丙嗪(Chlorpromazine)同位素分布确认 (右上图为氯丙嗪标准的同位素分布图，右下图为实际样品质谱图中氯丙嗪同位素分布情况) Q-Exactive为四级杆与Orbitrap的串联质谱，可以得到高分辨、高质量精度的二级子离子质谱图。在Exactfinder中可以将所有标准样二的二级谱图建立二 级质谱库，实际样品分析可以通过二级谱图的库搜索进行定性确认。图3为基质加标样品中克仑特罗的二级谱图确认结果。 图3克仑特罗 (clenbuterol)二级谱图确认 Q-Exactive具有高达140000的分辨率、出色的质量精度、高灵敏度和宽动态范围等特点，是兼具定性和定量功能的质谱分析平台，适合食品安全领域未知残留物的大范围筛查和定性定量分析。本文采用 Q-Exactive，在筛查软件Exactfinder的辅助下，建立了动物源食品中81种兽药残留同时筛查的方法，该方法简单、快速、准确、灵敏度高，能同时完成对81种兽残的定性定量分析。 Q-Exactive是赛默飞世尔科技在2011年推出的新型四极杆和轨道阱杂交高分辨质谱仪，它将高选择性四极杆的离子过滤与Orbitrap高分辨准确质量数（HR/AM）测量技术相结合，在分辨率、扫描速度和灵敏度性能上进一步提升，并提供各种高分辨扫描功能，适应不同的应用需要。Q Exactive质谱仪能进行高通量的目标物或非目标物筛选，能够实现高可靠性的确证和定量分析，Q Exactive的高性能、稳定性和可操作性为前沿研究和常规检测提供更加可靠的分析结果。本文利用Q-Exactive液相色谱质谱联用系统，建立了动物源中多组分兽药残留同时筛查的快速分析法。