厨房用具中4-氯苯胺检测方案(液相色谱仪)

「应用纪要WatersTHE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 「应用纪要 使用ACQUITY UPLC I-Class系统和Xevo TQ-S micro定量分析聚酰胺厨房用具中的初级芳香胺 沃特世解决方案 ACQUITY UPLCI-Class系统 Xevo TQ-S micro ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱 MassLynx°Ms软件 TargetLynx"XS应用软件 简介 初级芳香胺(PAAs)是一类化合物，其中最简单的形式是苯胺(图1)。 PAAs可用于生产某些着色剂(例如偶氮颜料)，尤其是黄-橙-红色系列的着色剂。虽然大部分PAAs都不会威胁人类健康，但某些PAAs却是已知的人类致癌物。某些厨房用具、餐巾纸、烘焙食品包装袋上印有彩色图文或其他内容，如果它们与食品接触时，其中的PAAs迁移到食品中，会对人类健康构成威胁。 化合物 质量 结构 苯胺 93 NH2 邻甲苯胺 107 NH2 .CH3 2，4-二氨基甲苯 122 .CH3H2N NH2 邻甲氧基苯胺 123 NH2 OCH3 图1.几种PAAs的化学结构。 PAAs， 初级芳香胺，厨房用具，餐具，迁移，食品接触材料， FCMs 由于存在潜在的健康风险，监管机构规定了特定迁移限量(SML)。针对塑料的法规EU 10/2011规定："塑料材料及塑料制品不得向食品或食品模拟物中释放超过可检出限量的初级芳香胺，附件|的表1中所列的项目除外。检出限量为每kg食品或食品模拟物中不超过0.01mg此类物质。此检出限量的限定对象为释放出的初级芳香胺之总和。" 法规10/2011规定，在测定迁移自厨房用具聚酰胺材料的初级芳香胺时，如果首次提取物的测定结果符合不超过0.01 mg/kg的总SML (SML(T))要求，则只需进行一次迁移检测。然而，如果首次食品模拟物提取检测结果超出了允许的SML(T)，则必须继续进行两次迁移检测。该PAAs迁移检测采用食品模拟物B(3%(w/v)乙酸)进行提取，因为该模拟物已被证明可代表聚酰胺厨房用具迁移出PAAs的最坏情况3. PAAs是分子量较小的碱性化合物，在低pH条件下会发生离子化。由于这种物质呈碱性，而分析时使用3%乙酸作为样品溶剂，因此某些PAAs在色谱柱柱前端保留较差，进而导致峰形较差和/或保留损失。为了改善色谱保留性能，我们通常使用离子对试剂。遗憾的是，这类试剂对电喷雾的灵敏度有不良影响，应尽量避免使用。 本应用纪要介绍了一种将Waters° ACQUITY UPLC I-Class系统与Xevo TQ-S micro相结合，用于分析迁移自厨房用具的23种常见PAAs的LC-MS/MS方法。这种方法不需要使用离子对试剂来改善色谱保留性能。 UPLC条件 UPLC系统： ACQUITY UPLC I-Class 样品管理器： 流通针式(FTN) 色谱柱： ACQUITY UPLC HSS T3， 1.8 um， 2.1×100mm 流动相A： 水 流动相B： 甲醇 柱温： 45°C 样品温度： 10°C 流速： 0.4mL/min 运行时间： 15 min 进样体积： 20 pL 梯度： 0 min 5%B 10 min 100%B 12 min 5%B 12.01 min 5%B 15 min 5%B MS条件 MS系统： Xevo TQ-S micro 电离模式： ESI + 毛细管电压： 2kV 脱溶剂气温度： 600C 脱溶剂气流速： 1200 L/h 离子源温度： 150°C 采集模式： 多重反应监测(MRM) MS方法和数据采集 除非另有说明，否则均使用两个MRM通道。利用MS方法中内置的依据每个峰所需数据点自动选择驻留时间。利用MassLynx 4.1版软件采集数据，并用TargetLynx XS应用软件进行处理。表1汇总了所有MRM通道。图2展示了MRM方法的保留时间窗口。 表1.所有23种PAAs的MRM通道概览。 图2.PAAs采集方法的保留时间窗口。 标准品 混合标准品溶液中所有PAAs的浓度均为100 ug/mL。用3%乙酸食品模拟物溶液进一步稀释工作标准溶液，采用浓度范围为0.78 ng/mL~100 ng/mL的稀释系列为标准溶液。 样品制备 ( 根据EU 10/2011指导原则所述的步骤，用3%乙酸溶液对九种聚酰胺厨房用具进行提取1。 ) 结果与讨论 UPLC方法开发 由于PAAs呈碱性，而我们使用乙酸作为迁移模拟物，因此某些PAAs在色谱柱柱前端保留较差，进而导致峰形较差和/或保留损失。苯胺较早洗脱，因而容易产生上述效应。为此，9一些参考文献提出使用离子对试剂。进样前将氢氧化铵加入3%乙酸样品中，能够提高样品pH，使得极性和弱碱性PAAs(例如苯胺)变为中性形式。我们将10 pL 25% NH OH溶液加入1mL样品中，得到了更稳定的结果，所以此法优于使用离子对试剂的方法。图3展示了未调节pH(上图)和调节pH值之后(下图)的苯胺色谱图。中和pH之后，苯胺峰形显著改善，无需使用离子对试剂。 图3.未调节pH(上图)和调节pH值之后(下图)，3%乙酸食品模拟提取物中苯胺的色谱图。 图4.所有23种PAAs的色谱图。 线性 我们制备浓度范围为0.78 ng/mL~100ng/mL的所有PAAs标样，并绘制了标准曲线，下图给出了苯胺的数据作为示例(图5)。每条校准曲线均采用线性回归和1/X加权。所有化合物在上述浓度范围内均表现出良好的线性以及优异的%残差。 图5.苯胺在0.78~100 ng/mL浓度范围内的校准曲线(下图)和残差图(上图)。 酸化流动相有助于化合物的质子化，从而提高正离子电喷雾的灵敏度。由于色谱分离流动相中未添加酸，我们考察了柱后添加(PCA)甲酸是否对分析有利。我们利用Xevo TQ-S micro内置的IntelliStart"流路，以20pL/min的流定流速将2%甲酸溶液注入流出UPLC色谱柱的液流中。如此一来，甲酸溶液将被流动相稀释20倍，因此进入ESI源的甲酸终浓度为0.1%。图6展示了如何在采集方法中配置此PCA方法，而图7展示了采用(上图)和不采用(下图)柱后添加方法分析一系列PAAs所得的色谱图。为了便于说明，坐标轴强度互相关联。从色谱图中可以看出，向洗脱液中加入甲酸之后，灵敏度得到显著改善。 图6.在MS采集方法中设置柱后添加(PCA)方法。 图7.采用(上图)和不采用(下图)甲酸柱后添加方法 分析以下PAAs所得的结果表明，该方法可提升灵敏度：A.苯胺、B.邻甲苯胺、C.4-氯苯胺、D.2，4，5-三甲基苯胺、E.2-甲氧基-5-甲基苯胺以及F.4-氯-2-甲基苯胺。 表2汇总了使用该PCA方法分析所有化合物的定量限(LOQ)。LOQ是指信噪比(S/N)为10：1时的分析物浓度。使用原始数据并应用峰到峰算法计算S/N。大多数情况下都采用外推法计算LOQ，因为即使在报告的最低标准品浓度0.78 ng/mL下， S/N值仍然非常高。LOQ计算值在20 pg/mL以下的数据没有具体列出，仅记录为低于此浓度。报告的LOQ浓度范围为20 pg/mL~300 pg/mL. 基质效应 该方法不使用内标。因此，我们考察了食品模拟物提取液是否会导致离子抑制。将其中一个样品加标至最终浓度10 ppb， 并将该样品与溶解于相同食品模拟物溶液中的标准品进行对比。所有加标回收率均处于90%~107%范围内，说明对于所考察的23种化合物，基质效应很低或不存在。 化合物 信噪比 LOQ (ng/mL) 苯胺 377 0.02 邻甲苯胺 768 <0.02 2，4-二氨基甲苯 52 0.15 邻茴香胺 89 0.09 4-氯苯胺 323 0.03 2，4，5-三甲基苯胺 693 <0.02 2-甲氧基-5-甲基苯胺 1444 <0.02 4-氯-2-甲基苯胺 3503 <0.02 2-氨基萘 1858 <0.02 2-甲基-5-硝基苯胺 27 0.29 4-氨基联苯 226 0.04 2-氨基联苯 272 0.03 联苯胺 559 <0.02 4-苯基偶氮苯胺 1931 <0.02 4，4'-二氨基二苯甲烷 1353 <0.02 4，4'-二氨基二苯醚 312 0.03 3，3'-二甲基联苯胺 165 0.05 4，4'-二氨基二苯硫醚 2582 <0.02 邻氨基偶氮甲苯 1746 <0.02 3，3'-二甲基-4，4'-二氨基二苯甲烷 1818 <0.02 3，3'-二甲氧基联苯胺 528 <0.02 3，3'-二氯联苯胺 926 <0.02 4，4'-亚甲基双(2-氯苯胺) 1522 <0.02 表2.所研究的3种PAAs浓度为0.78 ng/mL时的S/N计算值，以及估算的LOQ值。 厨房用具样品 我们使用外部校准曲线对九种厨房用具样品进行了定量分析。九个样品中均检出苯胺和4，4'-二氨基二苯甲烷(浓度分别为0.4~1.1ppb和0.04~0.11ppb)，但未检出其他PAAs。图8所示为含有0.4 ppb苯胺的样品和含有0.04 ppb 4，4'-二氨基二苯甲烷的样品的色谱图。从图中可以看到，在上述亚ppb水平，分析灵敏度非常出色。 图8.厨房用具样品中浓度为0.4 ppb的苯胺的色谱图(左图)，以及含0.04 ppb 4，4'-二氨基二苯甲烷的样品的色谱图(右图)。 结论 本研究展示了一种针对23种PAAs的高灵敏度分析方法，且样品制备过程非常简单。以氢氧化氧作为中和试剂，并通过IntelliStart的内置流路以柱后添加方式向Xevo TQ-S micro分析流路中添加甲酸，可实现低至亚ppb级的高灵敏度分析。此法在较宽的浓度范围内(最高浓度达100 ppb)呈线性。除苯胺的检出浓度为0.4~1.1ppb，4，4'-二氨基二苯甲烷的检出浓度为0.04~0.11ppb以外，样品的检测结果均低于检测限。所有样品的总PAAs含量均低于法规EU 10/2011规定的SML(T)限值0.01 mg/kg. ( 参考文献 ) ( 1 . C ( ommission Regulation (EU) No 10/2011 of 14 January 2011 on plastic materials and articles intended to come into contact with food. ) ( 2.[ LB-NA-24815-EN-N， Technical guidelines ontesting the migration of primary aromatic aminesfrom polyamide kitchenware and of formaldehyde from melamine kitchenware. ) ( A nalysis of primary aromatic amines (PAA) in blacknylon kitchenware 2014. Selected samples f r om theNorwegian Market. ) THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. ( Waters、Xevo、 ACQUITY UPLC 、 UPLC、MassLynx和The Science of Wh a t's Possible是沃特世公司的注册 商 标。 TargetLynx和IntelliStart是沃特世 公 司的商标。其商所有商标均归各自的拥有者所有。 ) 扫一扫，关注沃特世微信 沃特斯中国有限公司沃特世科技(上海)有限公司 北京：010-52093866 上海：021-61562666 广州：020-28295999 成都：028-67653588 香港：852-29641800 定量分析聚酰胺厨房用具中的初级芳香胺 本应用纪要介绍了一种将Waters ACQUITY UPLC I-Class系统与Xevo TQ-S micro相结合，用于分析迁移自厨房用具的23种常见PAAs的LC-MS/MS方法。这种方法不需要使用离子对试剂来改善色谱保留性能。