人血清中维生素E检测方案(液相色谱仪)

DLPME-HPLC同时测定微量人血清中的维生素A和E 郑凤家1 别明江2 孙成均1* 1. 四川大学华西公共卫生学院，成都 610041； 2. 四川大学华西第四附属医院检验科，成都，610041 摘要：[目的]建立了人血清中维生素A和E的分散液相微萃取（dispersive liquid phase microextraction，DLPME）- 高效液相色谱分析方法。[方法] 取血清20μl，加入50μl甲醇，漩涡震荡10s后加50μl三氯甲烷超声萃取，高速离心后吸取下层三氯甲烷层供高效液相色谱分析，标准曲线法定量。色谱分析条件为：色谱柱为Eclipse XDB - C8 （150 mm × 4.6 mm，5μm ）；流动相为甲醇-水（96+4）；流速为0.80 ml/min ；柱温为25℃；紫外检测波长：维生素A为325nm，维生素E为292nm。[结果]维生素A和E标准曲线的相关系数均大于0.999；相对标准偏差均小于5%。对于20μl血清，本法的检出限维生素A为0.035μg∕ml；维生素E为0.09μg∕ml。维生素A和E 的加标回收率分别为90.4%～103.2%和81.0%～92.1%。[结论] 本法灵敏、准确、快速、简便，节约有机溶剂，适合于血清中维生素A和E的快速测定，是环境友好型的绿色分析方法。 关键词：分散液相微萃取；维生素A；维生素E；高效液相色谱；血清 Simultaneous determination of vitamin A and E in microamount of human serum by dispersive liquid phase micro-extraction – high performance liquid chromatography ZHENG Fengjia, BIE Mingjiang, SUN Chengjun* West China School of Public Health, Sichuan University, Chengdu 610041, China Abstract: [Objective] To establish a dispersive liquid phase microextraction–high performance liquid chromatography for simultaneous determination of vitamin A and E in microamout of human serum. [Method] Twenty microliter of human serum was taken and 50μl methanol added to precipitate the protein, and 50μl chloroform added to extract vitamin A and E ultrasonically. After centrifuged at 12000rpm for 5 min, the lower chloroform layer was taken and injected for HPLC analysis. The optimized chromatographic conditions were as follows: analytical column: (Eclipse XDB-C8, 150 mm × 4.6 mm，5μm); mobile phase: methanol-water (96+4); flow rate: 0.80 ml/min; column temperature: 25℃; detection wavelength: 325nm for vitamin A and 292nm for vitamin E, respectively. [Results] The correlation coefficients for the standard curves were greater than 0.999 for both vitamin A and E; the detection limits of the method were 0.035μg ∕ ml for vitamin A and 0.09μg ∕ ml for vitamin E. The recoveries of vitamin A and E in human serum ranged from 90.4%～103.2% and 81.0%～92.1%, respectively. [Conclusion] The method is sensitive, accurate, rapid, simple, and suitable for the determination of vitamins A and E in microamount of human serum. Key words : Dispersive liquid phase microextraction；Vitamin A；Vitamin E；Human Serum；High performance liquid chromatography *通讯联系人：孙成均，教授。E-mail：sunchj2005@yahoo.com.cn 维生素A 和维生素E是维持机体正常生长的必需脂溶性维生素。目前，国内外测定血清［1］和全血［2］中维生素A和E的方法很多。这些方法中的前处理技术有液－液萃取［1］、固相萃取［3］、浊点萃取［4］等等。这些前处理技术有的繁琐耗时、需要较多有机溶剂，且血清量需要量较大。整个样品分析过程中，前处理过程所需的时间占整个分析时间的2/3，并可能产生1/3以上的误差［5］。分散液相微萃取（dispersive liquid phase micoextraction, DLPME）技术首先见于Rezaee等[6-7]的报道，该法集萃取和浓缩于一体，是一种操作简单、快速、成本低且对环境友好的样品前处理新技术。现在分散液相微萃取技术对生物样品和环境样品中的农药［8-10］、重金属［11-12］等的提取报道很多，但在血清中维生素A和E的测定中尚未见报道。 本文将该技术应用于萃取浓缩微量人血清中的维生素A和E，大大缩短了分析时间，减少了样品和有机溶剂的用量，降低了分析成本，为分析人微量血清中维生素A和E的含量提供了快速、简便、准确、灵敏的方法，在人群血清维生素A和E的快速检测中有很好的应用价值。 1. 实验部分 1.1. 仪器与试剂 高效液相色谱仪（EX1600，上海伍丰科学仪器有限公司）,带紫外检测器（EX1600UV）；C8柱（Eclipse XDB-C8，4.6 mm × 15 cm，5.0μm），同类型保护柱；WH-1微型漩涡混合仪；台式高速离心机（Anke TGL-16B）；超声波清洗器(KQ-250型)。维生素A（视黄醇）标准品（FLUKA，99％）；维生素E标准品（Sigma，95%）；三氯甲烷（色谱纯）；甲醇（色谱纯）；维生素A 标准储备液（1mg/ml）：甲醇配制， 于-20℃冰箱冷藏保存；维生素E 标准储备液（2mg/ml）：甲醇配制，于-20℃冰箱冷藏保存；维生素A和E混合标准应用液（VA 1μg/ml，VE 5μg/ml）：测定前，按文献［13］方法对维生素A和维生素E标准储备液浓度进行标定，再以其实际浓度用甲醇稀释成混合液。实验用水为Millipore超纯水（18.2 MΩ·cm）。 1.2 实验方法 1.2.1 色谱条件 流动相为甲醇-水（96+4），超声波脱气后使用；流速：0.8 ml/min；柱温：25℃；波长切换程序：0～5.0min，325 nm，5.0～10min，292 nm。 1.2.2 标准曲线的绘制 在高效液相色谱仪基线达平直后，分别进样VA 和VE 混合标准应用液 2.00、5.00、10.0 、20.0μl（相当于VA 2， 5，10 ，20ng， VE 10，25，50，100 ng），以保留时间定性，记录各自峰面积。分别以VA和VE含量（ng） 对峰面积线性回归。维生素A和E标准色谱图见图1。 图1 维生素A和E混合标准色谱图 Fig 1 The chromatogram of vitamins A and E standard solution 1.维生素A（Vitamin A，3.8min） 2.维生素E（Vitamin E，8.4min） 1.2.3 样品处理与测定 取新鲜人血清20μl于200μl EP管中，加入50μl甲醇漩涡混匀10s，然后加入50μl三氯甲烷，超声萃取3min后，以 12000 r/min离心5min。用微量进样针伸入EP管底部取10μl萃取液进样分析，样品图谱见图2。 1.2.4 结果计算 根据样品图谱维生素A和E的峰面积，通过回归方程计算进样液中维生素A和E的含量（ng），按下式计算血清中维生素A和E的浓度（μg /ml） 。 式中：为维生素A和E的浓度（μg／ml），为由回归方程计算的进样液中维生素A或E的含量（ng）。 图2 样品萃取后维生素A和E的色谱图 Fig 2 The chromatogram of a human serum sample 1.维生素A（Vitamin A，3.8min） 2.维生素E（Vitamin E，8.4min） 2 结果与讨论 2.1 液相微萃取条件的优化 2.1.1 液相萃取剂的选择 实验选取了三氯甲烷、二氯甲烷、正己烷3种有机溶剂进行萃取条件试验。试验结果表明，在相同条件下，三氯甲烷的萃取效率及其稳定性要高于二氯甲烷和正己烷，二氯甲烷尽管萃取效率高，但易挥发，结果不稳定，故本法选三氯甲烷作为液相微萃取剂。 2.1.2 三氯甲烷萃取剂体积的选择 实验选择了20μl、40μl、50μl在相同条件下萃取样品，当萃取剂体积为20和40μl时，萃取效率偏低，且不稳定，当萃取剂量达到50μl时，萃取效率达到分析要求，且实验结果稳定性好，因此选择三氯甲烷萃取剂的体积为50μl。 2.1.3 超声萃取时间的选择 分散液相微萃取是一个样品的富集平衡过程，需要一定的时间。实验研究了1min、3min、5min这三个时间点的超声萃取效果，3min时效果最佳，而1min时萃取效率过低，这可能与超声时间过短，尚未达到富集平衡有关。5min时实验结果不稳定，这可能和超声时间过长，萃取剂挥发损失以及维生素A和E部分分解有关。所以，本法选择超声萃取时间为3min。 2.2 方法性能指标 2.2.1 标准曲线和工作曲线 本法实验条件下，维生素A和E的线性范围远大于实验范围，考虑到本法主要用于微量血清中维生素A和E的测定，故未测定线性范围上限。在本实验线性范围内，维生素A的标准曲线方程为：A=677.8m +23.95，相关系数r=0.9991；维生素E的标准曲线方程为：A=32.85m+70.5，相关系数r=0.9999。为了检验分散液相微萃取过程对标准系列的影响，在样品微萃取条件下对标准系列进行处理后再测定，结果所得维生素A的工作曲线方程为：A = 605.31m +18.85，相关系数r=0.9990；维生素E的工作曲线方程为：A = 35.96 m＋60.8 ，相关系数r=0.9990.分别对维生素A和E的标准曲线和工作曲线的斜率进行t检验，得p>0.05，即标准曲线和工作曲线的斜率无显著性差异，所以本法采用标准曲线法来计算样品中的维生素A和E的含量。 2.2.2 方法的检出限 以仪器基线的3倍噪声所对应的待测物在进样液的浓度为方法的检出限，以20μl血清，最终稀释至50μl，取10μl进样，计算出样品中维生素A和E的最低检出浓度为0.035μg∕ml和0.09μg∕ml。完全可满足实际样品测定的要求。 2.2.3 方法的精密度 取6份同一血清，各20μl，按样品处理方法提取和测定，计算方法的精密度（表1）。由表1可见，本法维生素A和E测定值的相对标准偏差分别为7.78%和5.43%。 表 1 方法精密度实验结果（n=6） 维生素 含量范围（ng） 均值（ng） SD（ng） RSD(%) Vitamin A 1.84～2.11 1.93 0.15 7.78 Vitamin E 21.0～23.1 21.91 1.19 5.43 2.2.4 方法准确度实验 在3份相同样品中，分别加入不同量的标准溶液，再按本法处理和测定，根据加标前后测定值计算加标回收率，实验结果见表2。由表2可见，本法维生素A和E的加标回收率分别为90.4%～103.2%（平均为94.9%）和81.0%～92.1%（平均为86.6%）。 表 2 方法加标回收率 维生素 背景值（ng） 加标量（ng） 测定值（ng） 回收率（%） 0.63 2.37 90.4 Vitamin A 1.80 1.26 3.10 103.2 2.52 4.10 91.2 8.77 28.1 81.0 Vitamin E 21.0 21.9 40.0 86.8 43.8 61.3 92.1 2.2.5 样品测定 用本法测定了15名健康成人的血清，所测维生素A的含量范围为（0.56±0.05）μg/ml。维生素E的含量范围为（8.46±0.57）μg/ml，与相关文献的报道值一致。 3 结论 本文建立了分散液相微萃取-高效液相色谱法分析维生素A和E的方法，该法操作简便，大大缩短了分析时间，节约了试剂，是环境友好型的分析方法，在维生素A和E的快速检验中有着很好的推广应用价值。 参考文献 ［1］ 徐军， 张慧芬， 邵裕坤，等. 高效液相色谱法测定人血中脂溶性维生素的含量 ［J］.中国药学杂志，2006，41 （2）：147-149 ［2］胡艳，王希希，孙成均. 高效液相色谱法同时测定微量全血中维生素A 和E［J］. 现代预防医学，2009，36（1）：120-122 ［3］ Chatzimichalakis P F， Samanidou V F，Papadoyannis I N. 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