重组人血白蛋白中半乳糖检测方案(离子色谱仪)

2 离子色谱-脉冲安培法测定重组人血白蛋白中甘露糖的含量 韩春霞赛默飞世尔科技(中国)有限公司 关键词：脉冲安培；人血白蛋白；甘露糖；含量 目标：建立脉冲安培检测法测定人血白蛋白中甘露糖的方法。 引言 白蛋白(又称清蛋白， albumin，Alb)是由肝实质细胞合成，在血浆中的半寿期约为15-19天，是血浆中含量最多的蛋白质，占血浆总蛋白的40%-60%。人血白蛋白是血液制品的一种，俗称“生命制品”、“救命药”。它是从健康人的血液中提炼加工而成，直接静脉注射到病人体内，其主要功能是增强人的免疫力和抵抗力。临床上主要用于失血创伤和烧伤等引起的休克、脑水肿，以及肝硬化、肾病引起的水肿或腹水等危重病症的治疗，以及低蛋白血症病人。 重组人血白蛋白具有血源人血白蛋白同样的适用范围。两相比较，后者由于是从人体血液中提取，不仅受到血源供应的限制，更受到血液中未知成分的影响，使得产品产量和质量控制难度较大，并且有潜在的安全隐患。重组人血白蛋白采用现代生物技术生产，完全摆脱了上述制约，并具有纯度更高、无动物组分、无病毒残留等优势。 甘露糖是重组人血白蛋白中的杂质，含量很低。本文建立了HPAEC-PAD法测定重组人血白蛋白中甘露糖含量的方法。CarboPac PA20色谱柱可实现甘露糖与其他单糖的分离，安培检测器利用氧化-还原反应原理对甘露糖进行检测，具有灵敏度高、准确性好的特点。 仪器 Thermo ScientificTM Dionex TM ICS-离子色谱系统，包括： - ICS-5000DP色谱泵 - ICS-5000 DC检测器 - AS-AP自动进样器 -ChromeleonTM 色谱工作站 耗材 ( T hermo ScientificTM Dionex OnGuard II R P Cartridges( 1 cc， P/N 057083) ) Thermo Scientific TM Target2 TM Nylon Syring Filters(0.45um， 30mm， P/NF2500-1) 一次性使用无菌注射器，1mL(上海治宇医疗器械有限公司) 去离子水(18.2MQ-cm， Thermo ScientificTM genPureProTM UV-TOC， P/N 50131948) 盐酸(国药，分析纯) NaOH溶液(50%w/w水溶液， Alfa Aesar ) 对照溶液的配制 精密称取甘露糖、葡萄糖、半乳糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖适量，加去离子水配制成含以上单糖各0.2、1、2、3、5mg/L的溶液。 样品前处理 (1)游离单糖测定取样品0.8mL，加乙腈1.2mL，摇匀，静置10min后，10000转离心10分钟。取上清液1mL，氮气吹干，加水5mL溶解，过0.22pm滤膜及RP柱。 (2)结合糖的测定 取样品0.1/0.2mL，加水2.9/2.8mL， 加入6N盐酸溶液3mL，摇匀，置90℃水浴中加热2小时。取上述溶液0.5mL，氮气吹干，加水2mL溶解，过0.22um滤膜。 色谱条件 分析柱： Thermo Scientific Dionex CarboPacPA20，3x150mm (P/N 060142) 保护柱： Thermo Scientific Dionex CarboPacPA20， 3x 50mm (P/N 060144) 氨基酸捕获柱：Thermo Scientific Dionex AminoTrap，3x50mm (P/N 060146) 淋洗液： 0-15min， NaOH 8mM； 15.1-20 min，NaOH 100mM， NaAc 300mM； 25-30min， NaOH 200mM； 30.1-35min，NaOH 8mM 进样体积： 10pL 柱温： 30℃ 检测器： 电化学检测，金电极(P/N046110)，标准糖电位 运行时间： 35min 动物蛋白中常见的单糖有甘露糖、葡萄糖、半乳糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖等。CarboPac PA20为阴离子交换色谱柱，使用氢氧化钠溶液作为淋洗液，可实现以上6种单糖的分离。AminoTrap氨基酸捕获柱，在低浓度氢氧化钠条件下，可实现对氨基酸的捕获，避免氨基酸对单糖的分离和测定产生影响。本样品为蛋白样品，在测定游离甘露糖和结合甘露糖时，均可能存在氨基酸的干扰，因此本实验的色谱柱选择AminoTrap色谱柱与CarboPac PA20色谱柱联用。分离图谱见图1、图2. 图1.单糖分离色谱图 图2.样品中单糖分离色谱图 线性范围与检出限 4种单糖的线性范围、相关系数、线性方程如表1所示。 表1.单糖的线性范围、相关系数和线性方程 色谱峰 浓度范围(mg/L) 相关系数% 截距 斜率 GlcN 0.2-5 99.97 0.000 2.291 Gal 0.2-5 99.60 0.000 1.265 Glc 0.2-5 99.93 0.000 1.805 Man 0.2-5 99.96 0.059 1.186 水解条件的选择 结合糖的浓度需对样品水解后测定。水解条件如酸浓度、温度等对水解效率影响很大，分别使用1N、1.5N、3N、6N盐酸溶液在80℃、90℃条件下水解1-7小时，测定样品在不同浓度及不同时间点水解得到的单糖浓度，通过比较，发现使用3N盐酸溶液在90℃水解2小时时，水解效率最高。 重现性 溶液放置24小时后，重复进样6针，主峰保留时间RSD为0.3%，峰面积RSD为0.3%。 结论 ( 本方法准确、灵敏，重复性好，可用于重组人血白 蛋白中的甘露糖测定。 ) 赛默飞世尔科技(中国)有限公司 免费服务热线：800810 5118 400 650 5118(支持手机用户) S CIENTIFIC SCIENTIFIC AN_C_IC-