灰叶胡杨花粉中总黄酮检测方案(微波萃取仪)

※工艺技术食品科学2009， Vol. 30， No. 02 61 超声-微波协同萃取灰叶胡杨花粉中总黄酮的工艺研究 汪河滨'，郭志愿，赵小亮1，张秀萍3 (1.新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室，新疆阿拉尔 843300；2.塔里木大学植物科技学院，新疆阿拉尔 843300；3.塔里木大学动物科技学院，新疆阿拉尔 843300) 摘 要：研究了超声-微波协同萃取法提取灰叶胡杨花粉中总黄酮的工艺。通过单因素试验确定了影响提取总黄酮的主要因素及最佳水平范围，通过正交试验确定的最佳提取条件为：乙醇浓度70%，提取时间40min， 提取次数3次，提取温度60℃，此条件下灰叶胡杨花粉总黄酮的提取率为2.783%。 关键词：灰叶胡杨花粉；总黄酮；超声-微波协同萃取 Study on Ultrasonic-Microwave Synergistic Extraction of Total Flavones fromPollen of Populus pruinosa Schrenk WANG He-binl， GUO Zhi-yuan²， ZHAO Xiao-liang'， ZHANG Xiu-ping’ (1. Xinjiang Production and Construction Corps Key Laboratory of Protection and Utilization of Biological Resources in Tarim Basin，Alar 843300， China ； 2. College of Plant Science and Technology， Tarim University， Alar 843300， China ；3. College of Animal Science and Technology， Tarim University， Alar 843300， China) Absstract ： The single factor analysis and orthogonal test were designed to confirm the main factors and the optimum conditionfor ultrasonic-microwave synergistic extraction process of total flavones from the pollen of Populus pruinosa Schrenk. The resultsshowed that the optimum condition is as following： ethanol concentration 70%， extraction for 3 times and 40 min for each time，extraction temperature 60 ℃， and finally the extraction rate of total flavones is 2.783%. Key words： pollen of Populus pruinosa Schrenk； total flavones； ultrasonic-microwave synergistic extraction 中图分类号：O623.54 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2009)02-0061-04 胡杨(Populus euphratic Oliv)、灰叶胡杨(Populuspruinosa Schrenk)隶属于杨柳科(Salicaceae)杨属(PopulusL.)木本植物，是新疆干旱荒漠区植被的建群种和优势种，具有较强的抗逆特性21。胡杨自然分布于北非、中东及我国西北干旱区的河岸和低湿的盐渍地。目前仅在我国的荒漠区保存大面积林地，集中分布于塔里木盆地13。灰叶胡杨仅分布在新疆南部塔里木河、叶尔羌河、和田河沿岸，其中和田下游是灰叶胡杨分布最集中的地区，与叶尔羌河下游的河岸林组成欧亚大陆面积最大的灰叶胡杨林分布区4。 国内外对胡杨各方面开展的研究内容很多，但有关灰叶胡杨花粉黄酮类成分的提取和含量测定方面的研究国内尚未见报道，花粉不仅携带着生命的遗传信息，而 且包含着孕育新生命所必需的全部营养成分和活性物质，近年来，花粉作为优良的全营养食物被全世界广泛关注，掀起一股花粉研究热。本实验以灰叶胡杨花粉为原料，采用超声-微波协同萃取法提取灰叶胡杨花粉总黄酮，确定最佳工艺，为开发利用灰叶胡杨花粉提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 灰叶胡杨花粉采自新疆塔里木盆地。 芦丁标准品 中国药品生物制品检定所；乙醇(95%)洛阳市化学试剂厂； NaOH 北京化工厂；硝酸铝 天津市晨化学试剂厂；亚硝酸钠 上海试剂一厂。以上 ( 基金项目：新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室开放课题(BR0707) ) ( 作者简介：汪 河 滨(1980-)，男，讲师，硕士，研究方向为天然产物化学。E-mail： wanghebin329@163.com ) 试剂均为分析纯。 1.2 仪器与设备 CW-2000超声-微波协同萃取仪 上海新拓微波溶样测试技术有限公司； BS124S 电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；T6新世纪紫外-可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司； SHB-3循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司。 1.3 方法 1.3.1 芦丁标准曲线的绘制 芦丁对照品溶液的制备：精密称取干燥至恒重的芦丁对照品10mg，加适量70%乙醇溶解，定容到10ml容量瓶中，配成浓度为1mg/ml的标准品溶液，备用。 最大吸收峰的确定：精确吸取芦丁对照品溶液0.2ml， 放于10ml容量瓶中分别加水3ml，加5%亚硝酸钠水溶液0.5ml，放置6min， 加10%硝酸铝0.5ml， 混匀放置6min 后，加5%氢氧化钠2.5ml，混匀，放置15min，定容至10ml。用紫外-可见分光光度计扫描波长200~800nm之间的吸光度，结果在500nm波长处有最大吸光度。 标准曲线的的绘：精密吸取对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7ml放入相应的10ml容量瓶中分别加水3ml， 加5%亚硝酸钠水溶液0.5ml， 放置6min，加10%硝酸铝0.5ml，混匀放置6min 后，加5%氢氧化钠2.5ml，混匀，放置15min 后，定容至10ml， 在波长500nm 下测吸光度。测定结果计算得标准曲线方程：A=10.393C+0.0008(r=0.9996，线性范围：10~70ug/ml)。 1.3.2 总黄酮测定方法 精密称取胡杨花粉1.000g，加一定浓度的乙醇溶液50ml，在一定条件下超声-微波协同萃取，过滤，收集滤液，定容至50ml，得供试品溶液。 精确移取供试品溶液1ml， 放入10ml容量瓶中，加水3ml，加5%亚硝酸钠水溶液0.5ml，放置6min，加10%硝酸铝0.5ml，混匀放置6min 后，加5%氢氧化钠2.5ml，混匀，放置15min 后， 定容至10ml， 在波长500nm处测定吸光度，根据标准曲线计算总黄酮的提取率。 1.3.3 灰叶胡杨花粉总黄酮的提取方法 1.3.3.1 单因素试验 以灰叶胡杨花粉总黄酮的提取率为指标，考察提取时间、提取温度、提取次数、提取溶剂浓度各单因素对其提取率的影响。 (1)提取时间试验：精密称取灰叶胡杨花粉1.000g，加70%的乙醇溶液50ml，在温度60℃条件下超声-微波协同萃取，提取时间分别为10、15、20、30、45min，过滤，收集滤液，用70%的乙醇溶液定容至50ml，按照1.3.2中总黄酮测定的方法测定，计算总黄酮的提取率。 (2)提取温度试验：精密称取胡杨花粉1.000g，加70%的乙醇享液50ml，在温度分别为：40、50、60、70℃条件下超声-微波协同萃取 30min， 过滤，收集滤液，用70%的乙醇溶液定容至50ml，按照1.3.2中总黄酮测定的方法测定，计算总黄酮的提取率。 (3)提取次数试验：精密称取胡杨花粉1.000g，加70%的乙醇溶液50ml，在温度60℃，提取时间30min条件下在超声-微波协同仪中分别提取1、2、3、4次，过滤，收集滤液，用70%的乙醇溶液定容至50ml，按照1.3.2中总黄酮测定的方法测定，计算总黄酮的提取率。 (4)提取溶剂试验：黄酮类化合物包括水溶性和脂溶性成分，乙醇毒性小、渗透性强、易于回收、价格也较便宜，因此选定不同浓度的乙醇为提取溶剂。 精密称取胡杨花粉1.000g， 在温度60℃，乙醇浓度分别为0、50%、70%、95%条件下超声-微波协同萃取30min， 过滤，收集滤液，用相同浓度的乙醇溶液定容至50ml，按照1.3.2中总黄酮测定的方法测定，计算总黄酮的提取率。 1.3.3.2 正交试验 在对以上单因素分析和试验的基础上，根据已有的资料和实际情况，对影响总黄酮提取效果的四个主要因素，每个因素三个水平(表1)，用L9(34)进行正交试验设计，以总黄酮的提取率为考察指标，选择最佳的提取条件。 表1 正交试验因素水平 Table1Factors and levels of orthogonal test 水平 因素 A时间(min) B温度(℃) C提取次数 D乙醇浓度(%) 1 20 50 1 50 2 30 60 2 70 3 40 70 3 95 2 结果与分析 2.1 单因素试验结果与分析 2.1.1 提取时间的影响 图1 提取时间对总黄酮提取率的影响 Fig.1 Effects of extraction time on extraction rate of total flavones 从图1可以看出，前30min，随着时间的延长，总黄酮提取率增加，30min 时提取率达到2.176%，30min后提取率减少。 2.1.2 提取温度的影响 图2 温度对总黄酮提取率的影响 Fig.2 Effects of temperature on extraction rate of total flavones 由图2可知，40℃至70℃下总黄酮提取率逐渐升高，70℃时达到2.252%，70℃以上溶剂基本达到沸腾，因此，本实验选取70℃以下温度提取。 2.1.3 提取次数的影响 提取次数(次) 图3 提取次数对总黄酮提取率的影响 Fig.3 Effects of extraction times on extraction rate of totalflavones 由图3可以看出，灰叶胡杨花粉总黄酮的提取率随着提取次数的增加而增大，提取三次时达到2.612%，提取四次时最大，达到2.625%，但和第三次相差不大，因此本实验认为三次提取已经较为充分，效果较好。 2.1.4 提取溶剂的影响 由图4可以看出，乙醇浓度在0~70%以内总黄酮提取率随乙醇浓度的增大而增大，乙醇浓度在20%~70%范围内增加显著，在70%以后提取率降低。 图4 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响 Fig.4 Effects of ethanol concentration on extraction rate of totalflavones 2.2 正交试验结果与分析 表2 L(34)正交试验结果 Table 2 Results of L(34) orthogonal test 因素 试验号 总黄酮提取率(%)A提取时间B提取温度C提取次数D乙醇浓度 1.2418 2 2 2 2.1564 3 3 3 3 1.9223 4 2 1.3489 5 3 2.3689 6 3 2 1.7039 7 3 1 3 2 2.6583 8 3 2 1 3 1.5632 9 3 3 2 1 1.4907 k1 1.774 1.750 1.503 1.700 k2 1.807 2.029 1.665 2.173 k3 1.904 1.706 2.317 1.611 极差 0.130 0.323 0.814 0.562 表3 方差分析 Table 3Analysis of variance 因素 偏差 自由度 F比 显著性 提取时间 0.028 2 1.000 提取温度 0.185 2 6.607 提取次数 1.112 2 39.714 * 乙醇浓度 0.546 2 19.500 * 误差 0.03 2 注： F0.0s(2，2)=19， Fo.0i(2，2)=99；*.差异有显著性。 由结果分析(表2、3)可以看出，各因素对总黄酮提取率影响的主次顺序为C>D>B>A，即提取次数>乙醇浓度>提取温度>提取时间，最佳条件为AB2C：D2，即乙醇的体积分数为70%、提取时间为40min、提取次数为3次、提取温度为60℃。方差分析表明提取次数和乙醇浓度对试验具有显著性影响(p<0.05)。 2.4 验证实验 根据筛选得到的最佳提取条件AsB2C：D2， 平行提取3次，计算总黄酮的提取率。结果见表4。经实验验 证，根据最佳的提取条件所得的总黄酮的提取率均大于正交设计中总黄酮的提取率，因此本最佳工艺条件合理，同时也表明此工艺具有较好的稳定性。 表4 最佳工艺的验证 Table 4 Verification of optimum technology 样品 总黄酮提取率(%) 平均提取率(%) RSD(%) 1 2.744 2 2.773 2.783 1.61 3 2.832 3 结 论 通过单因素试验和正交试验确定用超声微波协同萃 取法提取灰叶胡杨花粉总黄酮的最佳提取工艺为：乙醇浓度70%，提取时间40min，提取温度60℃，提取次数3次，该条件下灰叶胡杨花粉中总黄酮的提取率可达2.783%。 ( 参考文献： ) ( [1] 中国科学院兰州沙漠研究所遍委会.中国沙漠植物志：第一卷[M].北京：科学出版社，1985. ) ( 2] 李志军，于军，徐崇志，等.胡杨、灰叶胡杨花粉成分及生活力的比较研究.武汉植物学研究，2002，20(6)：453-456. ) ( [3] 李志军，刘建平，于军，等.胡杨、灰叶胡杨生物生态学特性调查 [].西北植物学报，2003，23(7)：1292-1296. ) ( [4] 魏鬼莒.胡杨[M].北京：中国林业出版社， 1990：1-99. ) China Academic Journal Electronic Publishing House. 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