牛奶中苯甲酰氨基醋酸检测方案(有机质谱仪(Organic-MASS))

牛奶的真实性一有机与非有机 R. J. Packer and A. Dalmia PerkinElmer Inc.， 710 Bridgeport Avenue， Shelton， CT， 06484 随着牛奶中污染物逐步被关注，包括有意或无意加入的化合物，越来越多的人开始转向购买有机牛奶(在美国，2011年1月至11月期间，有机牛奶的销售量增加了17%，其中低脂的有机牛奶销售量增加了15%)。需求的激增，加上高涨的食品和燃料价格，导致了有机牛奶的供应短缺。由于需求超过供给，在任何地方，1加仑有机牛奶的成本都比普通牛奶高出25%至100%，因此，用普通牛奶代替有机牛奶销售，对那些欺诈者来说是具有吸引力的方法。在美国和欧盟国家，有机产品的标签预示着更加严格的农场生产规范，然而这并不是所有国家情况，但是，也并不仅仅是快速发展的亚洲和南美洲经济体存在欺欺的问题，随着有机奶粉出口的增长，这些假冒的有机奶粉能够通过分销商或者更进一步的食品生产途径进入西方，比如巧克力，如果称其为有机产品，将获得更高的价格。虽然这些替代品不会导致健康问题，但是这仍然是欺诈，消费者并没有获得他们支付所该得的，且那些辛勤劳作的有机产品农场主失去了生意，他们的利润空间也被侵蚀。 有机和非有机牛奶之间的区别是什么? ·当生产有机牛奶时，农场主必须遵守以下的规程(不同的国家有不同的规程，以下是美国制定的规程)： ·放牧的时间农场主必须保证，在必须的放牧季节，奶牛的日常饲料至少30%是牧草(至少120天)。 ·抗生素的使用一有机奶牛不能使用抗生素作为常规治疗。如果一头奶牛必须使用抗生素，那么该奶牛的牛奶不允许参与奶制品的生产过程，直到12个月无抗生素的鉴定获得通过。 ·牛生长激素(BGH) 来来自于有机农庄的奶牛不允许注射BGH。 ·农药的使用一在有机奶牛场禁止使用农药。有机奶牛不能喂食使用了农药的牧草。 如何检测? 色谱技术，如LC-MS和HPLC， 能够被用作测定牛奶或者动物饲料中痕量的农药、抗生素，甚至生长激素，如果主要给奶牛喂食商业饲料，而不是新鲜的牧草或者青储饲料，那么这种牛奶仍然不能称为有机牛奶。一种尝试区分有机和非有机牛奶特征的技术是同位素质谱或者IRMS。然而近来的一些工作致力于研究牛奶中微量量的含量水平。一项研究是使用GC-MS来测定有机和非有机牛奶中的长链脂肪酸的含量。由于有机奶牛吃了更多新鲜绿色的饲料，它们获得了更多的叶绿醇(部分叶绿素)，这些叶绿醇在反刍动物的胃中被分解成长链脂肪酸。该研究发现，就平均水平而言，有机牛奶中长链脂肪酸的含量是普通牛奶中的双倍(有机牛奶中大约含量为300mg/100g，常规牛奶为150mg/100g)。另外一个研究是建议使用苯甲酰氨基醋酸的含量进行分析，结果再次发现，食用了更多青草和青储饲料的动物奶中苯甲酰氨基醋酸的含量高，虽然这项研究是以山羊奶为研究对象。 加快分析 不变的是，绝大多数的分析技术包括了等待分离的时间。如直接样品分析质谱或者DSA-MS技术能够直接进行样品电离并连续的引入质谱，这就意味着需要花费1h分析样品的传统色谱应用技术，现在仅需要花费1min 试验： 从当地的市场上购买了3种有机牛奶和3种普通牛奶，所有的牛奶样品进行了同样的处理，首先1mL的牛奶样品与2mL乙腈及1mL甲醇混合沉淀蛋白，然后7800RPM离心10min， 最后在1mL上清溶液的样品中加入内标物，d5-苯酰氨氨基醋酸，并使每个样品中内标的浓度均为5mg/L。然后，用移液管转移每个样品沉淀的蛋白10mL至Axion DSA的不锈钢附件上等待电离和分析。DSA的附件和Axion 2 TOF的实验参数见表1所示。 DSA参数 值 加热温度 350℃ 辅助气体压力 80psi 干燥气流量 3L/min Corona 电流 -5uA 板末端电压 200V 毛细管入口电压 800V TOF参数 值 模式 脉冲(负) 飞行管电压 8kV 质量范围 100-700m/z 谱图/秒 10 毛细管出口电压 -100V 表1分析牛奶中苯甲酰氨基醋酸的实验参数 结果： 图1是第一个有机牛奶沉淀蛋白的质谱图，很明显主要的信号来自于苯甲酰氨基醋酸和氘代的苯甲酰氨基醋酸标准品。对这些峰进行更详细的分析，并且将它们叠加，图2，我们可以发现，出现在这个区域的色谱峰，苯甲酰氨基醋酸的响应是是代标准品的1.692倍。重复这样的过程，图3，发现普通牛奶中苯甲酰氨基醋酸与气代标准品两者的响应比例接近1，为0.932。 图1第一个有机牛奶样品沉淀的蛋白5ppm加标质谱图 图2第一个有机牛奶样品的苯甲酰氨基酰酸和d5-苯甲酰氨基醋酸 (5mg/L)提取离子色谱图(EIC) 图3第一个普通牛奶样品的苯甲酰氨基醋酸和d5-苯甲酰氨基醋酸(5mg/L)提取离子色谱图(EIC) 讨论： 所有6个样品的测定结果，见表2所示。由此可以看出，所有3个普通的牛奶样品苯甲酰氨基醋酸与参考标准品两者的响应比例大约为1：1。考虑到稀释倍数，计算得到普通牛奶中苯甲酰氨基醋酸的含量大约为20mg/L。对于有机牛奶样品1和2，很明显其中苯甲酰氨基醋酸含量较高，与假设结果一致，该类样品中苯甲酰氨基醋酸的含量大约为35 mg/L， 是普通牛奶样品中苯甲酰氨基醋酸含量的1.75倍。不幸的是，其中一个有机牛奶样品中苯甲甲氨基醋酸的含量甚至比普通牛奶样品还低。一种可能的解释是，这款特定的样品是超市“家用”或者通用的品牌，而不是其标签标明的所谓“有机牛奶”。但是，为了证明这种情况，需要进行更广泛的研究，将一群奶牛分为两组，一组喂食有机饲料，一组喂食常规饲料，测定在过去一年中两组牛奶中的苯甲酰氨基醋酸含量，类似于报道的一项对山羊的研究。 牛奶种类 苯甲酰氨基醋酸与5mg/L 气代标准品的响应比 苯甲酰氨基醋酸在牛奶中的含量 有机牛奶1 1.692 33.48mg/L 有机牛奶2 1.837 36.73mg/L 通用有机牛奶3 0.864 17.28mg/L 普通牛奶1 0.923 18.45mg/L 普通牛奶2 0.998 19.96mg/L 普通牛奶 3 1.075 21.51mg/L 表2苯甲酰氨基醋酸在有机和普通牛奶样品中含量 结论： 该工作证明通过DSA-MS采用一种已知准确浓度的参考标准来测定牛奶中苯甲酰氨基醋酸的含量是可行的(而不是使用标准曲线)。也有证据表明，苯甲酰氨基醋酸含量可以用来确定奶牛是否采用有机饲料喂养，但这将需要更广泛的研究结果来证明。该应用文献开拓了一台仪器分析农药、生长激素、抗生素和有机饲料的可能性，从而可以明确的检查有机类商品。 ( 参考文献： ) ( 1. h t t p ：/ / ww w.fo o dd igital.c om/ produc tio n / o rganic-m i lk-f a ces-sh o r t ages-and-ri s ing- popu larity ) ( 2. http：// u satoday30.usatoday.com/news/h e alth/wellness/fitness-food/story/2012-02-16/Organ i c-mi l k-low-as-demand- up - and-farmers- st ru g gle/531 1 3812/1 ) 3. http：//articles.latimes.com/2010/feb/13/business/la-fi-dairy13-2010feb13 ( 4. http：//spryliving.com/articles/organic-milk-basics/ ) ( 5. Concentrations of phytanic ac i d an d pristanic acid are higher in o rganic than in conventional dairy products from the German market， W. Vetter and M. Schroder (2010) Food Ch e m.， 119(2)：746-752 ) ( 6. Differentiation of organic goats milk based on hippuric acid content as determined by capillary electrophesis， Carpio et al. (2010) Electrophoresis ， 31：2211-2217 )