氨基酸中柱前衍生分析检测方案(液相色谱仪)

LC-2010 的柱前衍生氨基酸分析 摘要 柱前衍生氨基酸分析是先将氨基酸衍生成具有可见光吸收或荧光发射的衍生物，然后在反相柱上分离，它不需要柱后反应装置，因此可以在配有相应检测器的普通高效液相色谱仪上分析。使用 LC-2010 高效液相色谱仪，考察了柱前衍生法进行氨基酸分析时的精密度和稳定性。 关键词 HPLC 柱前衍生氨基酸分析 HPLC分析条件 仪器： LC-2010系统 色谱柱： shim-pack VP-ODS(4.6mmIDx150mmL) 柱温：36℃ 流动相：A10mM磷酸缓冲盐(pH=6.9) B乙腈 A/B=85/15 1mL/min 流动相梯度洗脱程序： TIME FUNC VALUE 30.00 B.CONC 64 30.01 B.CONC 100 34.00 B.CONC 100 34.01 B.CONC 15 40.00 Controller STOP 检测波长：254nm 样品：2.00pmol/mL标准氨基酸溶液(中国农业科学院分析测试中心研制，17种组分) 进样体积：： 4uL 柱前衍生步骤 1、200pL样品中加入100mM 异硫氰酸苯酯(乙腈溶液)100pL 和1M三乙胺(乙腈溶液)100pL，室温下放置1小时 2、反应液中加入400pL己烷，振荡 3、静置后，取下层液，一次性过滤器(0.45um)过滤 4、取滤液 4pL 注入 HPLC 采用上述步骤同批衍生10个样品 精密度试验 取同一份样品，连续测定6次，色谱图如图1。各组分保留时间 RSD 的最小值为 0.06%(Lys)，最大值为 0.29%(Pro)， 各组分面积的 RSD 最小值为 0.14%(Lle)，最大值为1.44%(Cys)，见表1。 稳定性试验 取10份样品，连续进样测定，色谱图如图2。各组分保留时间 RSD 的最小值为 0.32%(Phe)，最大值为 1.98%(Glu)， 各组分面积的 RSD 最小值为4.51%(Tyr)， 最大值为 13.82%(Asp)，见表2. 结果讨论 1、精密度试验中，各组分保留时间的 RSD<0.5%，峰面积的 RSD<1.5%。由此数据说明，本次试验中， LC-2010系统的精密度比较好。 2、稳定性试验中，通过峰面积的 RSD 可以看到， Asp 和 Glu 的稳定性不是太好，考虑到精密度试验的结果，这个差距应该是由于衍生试验的误差引起的。 3、除去最先进样的两个样品，重新统计了保留时间和峰面积的 RSD(见表3)。可以看出，峰面积的重复性没有变化，但是保留时间的重现性得到了一定程度的提高。因此认为，由于分析第一和第二个样品时，系统尚未完全稳定，导致了保留时间的漂移。 图1精密度试验 图2稳定性试验 表1精密度试验(R=6次重复进样) 表2稳定性试验(R=10个样品) Name Retention time Area %RSD %RSD Asp 0.22 0.62 Glu 0.24 0.54 Ser 0.21 0.45 Gly 0.21 0.54 His 0.21 0.40 Arg 0.26 0.46 Thr 0.27 1.25 Ala 0.28 0.47 Pro 0.29 0.38 lyr 0.19 0.25 Val 0.16 0.18 Met 0.15 0.41 Cys 0.11 1.44 Ile 0.08 0.14 Leu 0.07 0.24 Phe 0.06 0.39 Lys 0.06 0.44 Name Retention time Area %RSD %RSD Asp 1.98 13.82 Glu 1.98 6.64 Ser 0.98 7.14 Gly 0.91 7.43 His 0.81 6.59 Arg 0.56 6.15 Thr 0.77 8.70 Ala 0.74 6.85 Pro 0.70 7.22 Tyr 0.49 4.50 Val 0.46 5.87 Met 0.42 5.42 Cys 0.45 6.68 Ile 0.35 5.50 Leu 0.34 5.23 Phe 0.32 5.38 Lys 0.32 6.55 表3稳定性试验(R=8个样品) Name Retention time Area %RSD %RSD Asp 1.54 15.55 Glu 1.41 7.00 Ser 0.51 7.46 Gly 0.46 7.91 His 0.38 6.98 Arg 0.30 6.44 Thr 0.39 9.18 Ala 0.39 7.33 Pro 0.37 7.66 Tyr 0.30 4.61 Val 0.27 6.22 Met 0.25 5.70 Cys 0.24 6.75 Ile 0.18 5.76 Leu 0.18 5.22 Phe 0.16 5.79 Lys 0.17 6.93