单抗唾液酸化异构体中pH 梯度离子交换色谱高分辨率分离检测方案(液相色谱仪)

离子交换柱分离单克隆抗体 戴振宇许群梁丽娜赛默飞世尔科技(中国)有限公司 关键词 蛋白异质性；阳离子交换；糖基化； ProPac SCX-10色谱柱 目标 探索在 Thermo Scientific UltiMateTM 3000 双三元生物兼容高压液相系统上使用 ProPac° SCX-10色谱柱用盐梯度或 pH梯度离子交换色谱完成单克隆抗体唾液酸化异构体更高分辨率的分离。 引言 Thermo Scientific"M DionexM UltiMateM 3000×2双三元生物兼容性分析液相色谱系统，包括： -DGP-3600BM 生物兼容双梯度微流泵 -WPS-3000TBFC恒温生物兼容自动进样器(集成馏分收集) - TCC-3000SD 柱温箱 DAD-3000 二极管阵列检测器与13pL检测池体积流通池 Thermo Scientific M DionexM ChromeleonTM色谱数据系统软件， ( 7.2版本 ) ( Thermo Scienti f ic OrionM 2-Star 台式 pH十 ) ( 耗材 ) ( Thermo Scienti f icM Target2尼龙针头过滤器， 0.45 pm， 3 0 mm (P/N F2500-1) ) ( 去离子水，18. 2 MQ-cm (Thermo ScientificM G enPure Pro UV-TOCM， P/N 50131948) ) ( 2-丙醇(OptimaM)，≥99 . 9% (Fis h er Scientific， P /N A464-4) ) ( 磷酸二氢钠二水合物(N a H，PO.2H，0)，≥99.0% (Fisher Scientific， P/N S381-500) ) ( 硫酸铵((NH)，SOa)，≥99.0 % (Fisher Scientific P/N A702-500) ) ( (羟甲基)氨基甲烷(TRIS)，晶体(Fisher Scientific， P/N T 3 70-500) ) 咪唑，≥99.0% (Fisher Scientific， P/N 03196-500)氯化钠 (NaCI)，晶体/生物级(Fisher Scientific， P/N S671-500)哌嗪， 99% (Acros Organics， P/N AC13129-5000)三乙醇胺，≥99.0% (Fisher Scientific P/N T407-500) BIS-TRIS 丙烷 ，≥99.0% (Fisher BioReagents P/N BP2929-25) 1-甲基哌嗪，≥99.0% (Acros Organics， P/N AC15691-1000) 神经氨酸苷酶 (NE ENGLAND BioLabs， P/N P0720S) 该过程在供应商建议的反应条件上稍作修改。在1.5mL离心管中加入4pL(相当于20ug)单克隆抗体和 31 pL H，0.再加入5 pL的 10X G1反应缓冲液(供应商提供)，反应总体积为40u。，1最后加入10 pL的神经氨酸苷酶在37℃孵化1小时。 ( 色谱柱： Thermo Scientific ProPac SCX-10， 10pm， 4×250 mm， P/N 054995 Thermo Scientific ProPac SAX-10， 10 pm， 4×250 mm， P/N 054997 Thermo Scientific MabPac SEC-1 ， 5 pm， 4×300 mm， P/N 074696 ) ( Thermo Scientific ProPac HIC-10， 5 pm， 4.6×250 mm， P/N 074197 ) 流动相： Formula 1 (For ProPac SCX-10， 盐梯度离子交换)： (A)20mM NaH，PO4， pH 6.0； (B)20 mM NaH，PO， 500 mM NaCl， pH 6.0 Formula 2 (For ProPac SCX-10， pH梯度离子交换)： (A)2.4 mM Tris， 1.5 mM咪唑，11.6mM哌嗪， pH6.0； ( (B) 2.4 mM Tris ， 1.5 mM咪唑， 1 1.6mM， pH 9.5Formula 3(For ProPac SAX-10，盐梯度离子交换)：(A) 10 mM Tris， 1 5 mM NaCl， pH 9.0； (B ) 10 mM Tris，500 mM NaCl， p H 9.0Formula 4(For ProPac SAX-10， pH梯度离子交换)： ) (A) 20 mM 哌嗪，20mM三乙醇胺， 20 mM BIS-TRIS 丙 烷，20mM1-甲基哌嗪 ， and 5 mM NaCl， pH 10.5； (B) 20 mM 哌嗪， 20mM三乙醇胺， 20 mM BIS-TRIS 丙烷，20mM1-甲基哌嗪， and 5 mM NaCl， pH4.0 Formula 5(For MAbPac SEC-1 色谱柱)： 50 mM NaHPO， 0.3 M NaCl， pH6.8 Formula 6(For HIC-10色谱柱)： (A) 0.1 M NaHzPO， 2 M(NH)SO，7%2-丙醇， pH7.0； (B)0.1 M NaH，PO4， 7%2-丙醇， pH 7.0 梯度：离子交换色谱 0-30 min，0%B-100% B；30-35min， 100% B； 35.5-50 min， 0%B 疏水层析色谱 0-40min，0%B-100% B； 40-50 min， 100% B； 50.5-65 min， 0%B 进样体积：50pL 流速：：11.0mL/min 离子交换色谱 0.6 mL/min for HIC-10 色谱柱 0.3 mL/min for SEC-1 色谱柱 柱温：30℃ 检测： UV，280nm SEC 与 HIC柱对单克隆抗体的分离效果 SEC 与 HIC 色谱法常用于监测单克隆抗体的纯度。图1a显示了单克隆抗体分离在 SEC 柱上的分离。 SEC 色谱证明，单克隆抗体样品主要是单体(峰1)，也存在小部分的二聚体(峰2)和多聚体的聚集或未知杂质(峰3)。图1b显示了单克隆抗体通过 HIC柱的分离。先前报道显示 HIC可以分离单抗脱酰胺，发生在重链C末端的异质性和色氨酸氧化等翻译后修饰。色谱图显示该单克隆抗体样品可能有小部分样品具有上述修饰。图1显示了无论从分子大小和疏水性方面样品都具有比较高的纯度。 图1.使用(a) MabPac SEC-1色谱柱 (b) ProPac HIC-10 色谱柱对单克隆抗体的色谱分离 离子交换色谱是目前最有效的分析翻译后修饰的方法，通常可分为盐梯度和pH 梯度离子色谱。盐梯度最为常用，已成功地应用于各种翻译后修饰的分离，如C-末端赖氨酸裂解、酰胺化、谷氨酰胺环化、氧化以及脱酰胺化等.因为唾液酸化程度的差别会导致糖蛋白带电的差异，所以在理论上离子交换色谱是分离糖蛋白唾液酸化异构体的可行方法。最近， pH梯度离子交换色谱已经显示出能在蛋白质异构体分离上提供更高的分辨率的能力.作者比较了强阴离子柱(ProPac SAX-10)和强阳离子柱(ProPacSCX-10) 在盐梯度和 pH梯度条件下单克隆抗体电荷异构体 的分离。图2a示出了使用 ProPac SCX-10柱在盐梯度条件下不能有效地分离单克隆抗体的电荷异构体。相比较而言， 在 ProPac SAX -10 上 pH梯度和盐梯度上能分离出6个单克隆抗体电荷异构体，但这些异构体峰没有得到有效的基线分离(图2b和2c)。在这种分辨率进行精确的量化或者进一步单一异构体纯化都是有困难的。相比较而言，单克隆抗体电荷变体在 ProPac SCX-10 柱的 pH 梯度得到了很好的分离。如图2d所示，10个以上的单抗电荷变体可以被分离，并且峰的分辨率也是最好的。由变色龙软件计算出的各个主峰(峰3~7)分辨率数据列于表1。 表1.单克隆抗体电荷异构体分离度的比较 分离度 峰3 峰4 峰5 峰6 基于盐梯度的强阳离子交换 不适用 基于 pH梯度的强阴离子交换 1.40 1.41 1.44 1.44 基于盐梯度的强阴离子交换 1.52 1.50 1.47 1.48 基于pH梯度的强阳离子交换 3.05 2.73 2.54 2.83 图2.比较不同分离模式对单克隆抗体电荷异构体的分离： (a) 盐梯度强阳离子交换，(b) pH梯度强阴离子交换， (c)盐梯度强阴离子交换， (d) pH梯度强阳离子交换色谱分离 单克隆抗体电荷异构体的性质 因为该单抗电荷异构体在离子交换色谱上的分布形式与蛋白唾液酸化异构体在等电聚焦电泳 (IEF)图谱很相像，“所以，作者试图表明该单抗电荷异构体亦是由于唾液酸化的差异造成的。利用神经氨酸苷酶可以特异性地去除唾液酸。图3显示了单克隆抗体样品在有或无神经氨酸 苷酶处理时的结果。神经氨酸苷酶处理后，峰1-6完全消失和峰7和8增加。此现象与神经氨酸苷酶去除唾液酸后削弱了单克隆抗体表面的负电荷从而导致在阳离子交换色谱上保留有所增强一致。本实验证明了该单抗电荷异构体至少有部分原因是由于唾液酸化差异造成的。 图3.单克隆抗体经神经氨酸苷酶去除唾液酸前后的色谱图 (a)对照样品/不加神经氨酸苷酶，(b)样品/加入神经氨酸苷酶 本应用文摘表明了在 ProPac SCX-10柱上使用基于 pH梯度的强阳离子交换色谱可用于高分辨率分离单克隆抗体唾液酸化异构体。与常规的毛细血血电泳分析方法相比，该方法简便、直观、易于标准化。如果使用小颗粒填料和超高压液相，更可达到快速分离的效果(另有应用文献讨论)。 ( 致谢 ) ( 本文的完成得到了陈静、张婷婷等同仁的倾力协助，作者在此表示衷心感谢! ) ( 参考文献 ) ( l. Fukuda， M . N . ； S a saki， H . ； Lopez， L.； Fukuda， M . S urvival o f Recombinant Erythropoietin i n t h e C i rculation- t h e R o le of Carbohydrates.Blood. 1 989 73：84-89. ) ( 2 . Dionex (now part of Thermo Fi s her Scientific) Application N ote：Exploration of pH-Gradient lon-Exchange Chromatography forHigh-Resolution P rotein Separations in B iotechnology andProteomics， S unnyvale， C A ， 2012. [O n line] ht t p：//www.dionex.com/en-us/webdocs/110535-PN-LC-pH-Gradient-Proteins-12Mar2012-PO70013.pdf (accessed Jan8，2014) ) ( 3 Vlasak， J.； lonescu ， R. Heterogeneity of monoclonal antibodiesrevealed b y charge-sensitive methods. Cu r r Pharm Biotechnol.2008 D ec； 9(6)：468-81. ) ( .4 Chuan， K. H .； Lim， S.E； Martin，L.； Yu n ， C. Y.； Loh， SO. H. ； La s ne，F.； Song， Z. W. C aspase activation， s i alidase release a n d changesin sialylatio n pattern o f recombinant human e r ythropoietinproduced by CHO ce l ls in batch an d fed-batch cul t ures.Cytotechnology. 2006 51：67-79. ) ThermoFisherSCIENTIFIC SCIENTIFICAN_C_LC-      糖基化蛋白，包括促红细胞生成素、单克隆抗体和各种激素等，构成了目前已经得到临床使用的生物药物主要品种。通常附着于多糖分子的末端位置的唾液酸，在许多生物过程如细胞识别和迁移中发挥重要作用。另外，唾液酸也对蛋白质药物的特性，尤其对蛋白质药物的循环半衰期有显著影响。比如，唾液酸化的促红细胞生成素的循环半衰期是5.6 小时，而非唾液酸化的促红细胞生成素是1.4 小时。1 因此，监测蛋白质的糖基化，包括唾液酸化，对于糖蛋白的性质研究和生物药物的生产质量控制有重要意义。