乳品中抗生素检测方案(液相色谱仪)

采用安捷伦三重四极杆液质联用系统对乳品中抗生素多残留进行分析 应用简报 食品检测和农业 作者 摘要 李建中、胡楠、郭启雷、马鑫、薄涛 安捷伦科技(中国)有限公司 本文采用 Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统/6460三重四极杆液质联用系统建立了56种抗生素(包括磺胺、喹诺酮、四环素、β-内酰胺、大环内酯、林可胺类等)同时检测的分析方法。牛奶或乳粉经过乙腈沉淀蛋白提取后，经反相固相萃取柱通过式净化后，采用薄壳型填料反相 C18色谱柱- Agilent Poroshell 120EC-C18分离，经配有安捷伦喷射流 (AJS) 电喷雾离子源的安捷伦三重四极杆液质联用系统在正离子模式下监测。该方法在0.1-200 ng/mL 浓度范围内线性相关性良好，相关系数R’≥0.990； 在 5 ng/mL 添加浓度下，各化合物峰面积稳定性在0.40%-14.02%之间；各化合物仪器定量检测限 (LOQ)可达到 0.02-2.0 ng/g。 通过对方法灵敏度、精密度和线性范围等方法学参数进行考察，得到所建立的方法能在18 min 内对乳品中56种抗生素类目标化合物完成快速、高灵敏度的检测分析，完全满足法规监测要求。 前言 乳及乳制品是指以生鲜牛(羊)乳及其制品为主要原料，经加工而制成的各种产品，其已成为人们非常喜爱的日常食品之一。随着全球经济一体化和食品贸易国际化，乳及乳制品的质量安全已成为世界性的挑战和全球重要的公共卫生问题。其中兽药残留问题是影响其安全的最重要的因素之一。兽药是指用于预防、治疗、保健、诊断动物疾病或者有目的调节动物生产性能的药物及其制品，可以有效控制动物的疫情，提高动物的存活率，保证养殖业的健康发展。如果使用不当或者非法使用药物，过量的药物就会残留在动物体内，当人食用了兽药残留超标的动物性食品后，就会在体内积蓄，产生过敏、畸形、癌症等不良后果，直接危害人体的健康甚至生命。 目前我国乳制品中仍然存在着一些兽药残留超标的问题。在历年国家质检总局组织开展的乳制品风险监测项目中，已经展开的兽药残留检测包括氯霉素、青霉素类、磺胺类、四环素类、激素等。不同抽检批次的样品均有兽残检出。根据中华人民共和国农业部发布的第235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》，可以用于产奶动物但不得在乳制品中检出残留的兽药共有8种；禁止用于产奶动物的兽药共有39种，其中29种兽药禁止用于所有食品动物，10种兽药禁止用于产奶动物或特定种类的产奶动物12。 目前乳及乳制品中兽药残留检测方法及标准多采用液质联用法，但大都按兽药类别单独检测，开发同时高效检测乳品中多兽药残留的技术方法可以提高检测效率和通量，也是兽药残留检测技术的发展方向35。本文采用 Agilent 1290Infinity 液相色谱系统/6460三重四极杆液质联用系统建立了同时快速检测乳及乳制品中56种抗生素的确证定量方法，该方法可以满足对乳品中常见兽药残留的监测。 实验部分 试剂、化学品与消耗品 所有试剂和溶剂均为色谱纯级或者分析纯级。 甲醇和乙腈购自德国默克 (MERCK)。甲酸和乙酸铵购自美国 Sigma-Aldrich 公司。所用实验用水为 Millipore Milli-Q超纯水系统现制备的高纯去离子水。 标准品由天津乳品检测中心提供。所有标准品用甲醇配制为1 mg/mL储备液，储存在-20°℃冰箱内(有效期1年左右)。用乙腈：水 (50：50) 配制混合工作液(10pg/mL)， 储存在4℃下(有效期1个月左右)。使用时用乙腈：水 (10：90)对混合工作液进行适当逐级稀释后使用，现配现用。 ( 实验采用 Agilent Bond Elut Plexa 固相萃取 (SPE) 柱对样品提取液进行净化。 ) ( 仪器配置 ) 实验采用 Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统进行分离，其由下列部件组成： 。 Agilent 1290 Infinity二元泵 (G4220A) Agilent 1290 Infinity 标准自动进样器 (G4226A) Agilent 1290 Infinity 自动进样器冷却器 (G1330B) · Agilent 1290 Infinity 柱温箱 (G1316C) 采用配有安捷伦喷射流(AJS) 电喷雾离子源的 Agilent 6460三重四极杆液质联用系统，在正离子模式下进行检测。采用 Agilent MassHunter 工作站软件(B.07或以上版本)进行数据采集、确证和定量分析。 样品前处理 称取1g牛奶(精确至0.1 g) 于15mL聚丙烯离心管中，加入3mL乙腈，涡旋 30s，以10000 r/min 离心10 min， 取上清液于 15mL离心管中，再加入1 mL乙腈重复提取沉淀蛋白部分，将两次提取液合并，直接通过 Bond Elut Plexa SPE柱，在重力作用下收集全部流出液于15mL 离心管中，再取 0.5 mL 乙腈：水 (80：20， V/V) 洗脱 SPE 柱，收集全部洗脱液，合并流出液和洗脱液，35°℃水浴上氮气吹至约0.6mL，用水定容至1mL，涡旋混匀，过滤膜后上机测定。 称取0.1g奶粉(精确至0.1g)于15mL聚丙烯离心管中，加1mL水混匀，加4mL乙腈涡旋 30 s， 以 10000 r/min 离心10 min， 后面步骤同牛奶处理方法。 液相色谱条件质谱条件色谱柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18，离子模式：正离子3.0x100 mm， 2.7 pm干燥气温度：300 °C柱温：35°C干燥气流量：8L/min进样量：5pL鞘气温度：370°C自动进样器温度：10°C鞘气流量：12L/min流动相：A) 含2.5 mmol/L 乙酸铵和 0.1%雾化器压力：甲40 psi酸的水溶液B)乙腈毛细管电压：3000V流速：0.4 mL/min喷嘴电压：0V梯度程序：时间 B%AEMV400 V0 5MS和 MS'分辨率Unit5MRM参数如表1所示2010.0 4013.015.0停止时间：15 min 后运行时间： 3 min 表 1.化合物 MRM 参数列表 化合物 母离子(m/z) 子离子 (m/z) 碎裂电压(V) 碰撞能量(V) 碰撞池加速器电压(V) 保留时间 (min) 阿莫西林 366.1 349 90 4 3 3.01 (Amoxicillin) 114 15 氨苄西林 350.1 160 110 6 3 5.15 (Ampicillin) 106 12 阿奇霉素 749.5 591.3 180 30 3 7.98 (Azithromycin) 158 40 阿洛西林 462 246 110 10 3 8.96 (Azlocillin) 218 20 头孢氨苄 348 158 80 6 3 5.27 (Cefalexin) 140 22 头孢哌酮 646 530 110 8 3 7.6 (Cefoperzone) 143 30 头孢喹肟 529 396 110 10 3 4.94 (Cefpirome) 134 15 头孢噻呋 524 241 130 15 3 9.09 (Ceftiofur) 210 20 头孢洛宁 459 152 110 20 3 5.36 (Cephalonium) 123 8 金霉素 479.1 462 130 16 3 8.08 (Chlortetracycline) 444 19 结果与讨论 本文采用含有薄壳型填料颗粒的 Poroshell 120 EC-C18 色谱柱对乳品中56种抗生素进行了有效的色谱分离，此填料(2.7pm)和规格(3.0x100 mm)的色谱柱具有较高的分离柱效，同时具有较低的色谱压力和较高的柱载量，非常适合分析乳品基质中多药物残留。流动相中添加0.1%甲酸和2.5 mmol/L 乙酸铵可以促进正模式下的离子化效率。所得结果如图1。 响应 vs. 采集时间 (min) 图1.56种抗生素混合工作液 MRM 叠加图 6460三重四杆杆液质联用系统可充分满足对此类药物的检测要求，在 MRM 方法列表中给出了6460的碎裂电压(Fragmentor) 参考值。 实验在 0.1-200 ng/mL 浓度范围内测试了56种抗生素的定量线性，所得结果表明所有化合物在此浓度范围内具有良好的线性相关性，相关系数R均大于0.990，分别以林可霉素、沙拉沙星、红霉素、磺胺苯吡唑、四环素和氨苄西林为例如图2所示。逐级稀释混合工作液测试仪器方法定量检测限(LOQ)，各化合物 LOQ可达到0.02-2.0 ng/g， 结果见表 2。 浓度 (ng/mL) 响应红霉素(Erythromycin) 浓度(ng/mL) 图2.林可霉素、沙拉沙星、红霉素、磺胺苯吡唑、四环素和氨苄西林标准曲线(0.1-200 ng/mL) 表2.各抗生素药物仪器定量检测限(LOQ)结果 化合物 LOO 化合物 LOO 化合物 LOQ 化合物 LOO (ng/mL) (ng/mL) (ng/mL) (ng/g) 阿莫西林 0.1 头孢喹肟 0.1 磺胺间甲氧嘧啶 0.025 甲氧苄啶 0.025 (Amoxicillin) (Cefpirome) (Sulfamonomethoxine) (Trimethoprim) 青霉素V 0.5 哌拉西林 0.5 磺胺嘧啶 0.025 磺胺邻二甲氧嘧啶 0.025 (Penicillin V) (Pipracil) (Sulfadiazine) (Sulfadoxine) 氨苄西林 0.1 头孢洛宁 0.5 磺胺(对)甲氧嘧啶 0.025 磺胺苯吡唑 0.025 (Ampicillin) (Cephalonium) (Sulfameter) (Sulfaphenazole) 头孢氨苄 0.1 阿奇霉素 1 磺胺甲噻二唑 0.025 金霉素 0.5 (Cefalexin) (Azithromycin) (Sulfamethizole) (Chlortetracycline) 美西林 0.02 螺旋霉素 2 磺胺噻唑 0.025 土霉素 0.5 (Mecillinam) (Spiramycin) (Sulfathiazole) (Oxytetracycline) 苯唑西林 0.5 替米考星 0.5 磺胺醋酰 0.025 四环素 0.5 (Oxacillin) (Tilmicosin) (Sulphacetamide) (Tetracycline) 头孢哌酮 0.5 红霉素 0.02 磺胺甲恶唑 0.025 去甲金霉素 0.1 (Cefoperzone) (Erythromycin) (Sulfamethoxazole) (Demeclocycline) 阿洛西林 0.1 泰乐菌素 0.1 磺胺甲基嘧啶 0.025 恩诺沙星 0.025 (Azlocillin) (Tylosin) (Sulfamerazine) (Enrofloxacin) 头孢噻呋 0.5 克拉红霉素 0.1 磺胺氯哒嗪 0.025 沙拉沙星 0.025 (Ceftiofur) (Clarithromycin) (Sulfachloropyridazine) (Sarafloxacin) 青霉素G 0.1 罗红霉素 0.05 磺胺异恶唑 0.025 环丙沙星 0.025 (Penicilline G) (Roxithromycin) (Sulfisoxazole) (Ciprofloxacin) 氯唑西林 0.5 交沙霉素 0.05 磺胺二甲嘧啶 0.025 麻保沙星 0.5 (Cloxacillin) (Josamycin) (Sulfadimidine) (Marbofloxacin) 萘夫西林 0.1 白霉素 0.1 磺胺甲氧哒嗪 0.025 二氟沙星 0.025 (Nafcilin) (Sineptina) (Sulfamethoxypyridazine) (Difloxacin) 氟氯西林 0.5 林可霉素 0.02 磺胺喹恶啉 0.025 丹诺沙星 0.1 (Flucloxacillin) (Lincomycin) (Sulfaquinoxaline) (Danofloxacin) 双氯西林 0.5 克林霉素 0.02 磺胺吡啶 0.025 奥比沙星 0.025 (Dicloxacillin) (Clindamycin) (Sulfapyridine) (Orbifloxacin) 在牛奶基质提取液中添加混合工作液，从而获得浓度为 5 ng/mL的基质加标样品，连续进样6针测试稳定性。如图3和表3所示结果表明，56种化合物在基质低浓度添加下峰面积 RSD 在 0.40%-14.02%之间，完全满足测试的稳定性要求。 表3.各抗生素在基质低浓度 (5 ng/mL) 添加下的峰面积稳定性数据 化合物 峰面积 化合物 峰面积 化合物 峰面积 化合物 峰面积 %RSD %RSD %RSD %RSD 阿莫西林 0.67 头孢喹肟 1.72 磺胺间甲氧嘧啶 1.87 甲氧苄啶 1.56 (Amoxicillin) (Cefpirome) (Sulfamonomethoxine) (Trimethoprim) 青霉素V 3.66 哌拉西林 1.81 磺胺嘧啶 0.72 磺胺邻二甲氧嘧啶 2.79 (Penicillin V) (Pipracil) (Sulfadiazine) (Sulfadoxine) 氨苄西林 3.79 头孢洛宁 14.02 磺胺(对)甲氧嘧啶 3.42 磺胺苯吡唑 1.55 (Ampicillin) (Cephalonium) (Sulfameter) (Sulfaphenazole) 头孢氨苄 4.70 阿奇霉素 13.25 磺胺甲噻二唑 1.38 金霉素 3.58 (Cefalexin) (Azithromycin) (Sulfamethizole) (Chlortetracycline) 美西林 2.52 螺旋霉素 11.25 磺胺噻唑 3.22 土霉素 3.11 (Mecillinam) (Spiramycin) (Sulfathiazole) (Oxytetracycline) 苯唑西林 3.88 替米考星 7.57 磺胺醋酰 0.91 四环素 3.46 (Oxacillin) (Tilmicosin) (Sulphacetamide) (Tetracycline) 头孢哌酮 6.07 红霉素 1.52 磺胺甲恶唑 0.64 去甲金霉素 3.74 (Cefoperzone) (Erythromycin) (Sulfamethoxazole) (Demeclocycline) 化合物 峰面积 化合物 峰面积 化合物 峰面积 化合物 峰面积 %RSD %RSD %RSD %RSD 阿洛西林 3.03 泰乐菌素 1.15 磺胺甲基嘧啶 0.96 恩诺沙星 1.86 (Azlocillin) (Tylosin) (Sulfamerazine) (Enrofloxacin) 头孢噻呋 3.94 克拉红霉素 1.20 磺胺氯哒嗪 1.91 沙拉沙星 0.49 (Ceftiofur) (Clarithromycin) (Sulfachloropyridazine) (Sarafloxacin) 青霉素G 3.22 罗红霉素 2.12 磺胺异恶唑 0.40 环丙沙星 2.01 (Penicilline G) (Roxithromycin) (Sulfisoxazole) (Ciprofloxacin) 氯唑西林 5.44 交沙霉素 2.45 磺胺二甲嘧啶 2.28 麻保沙星 3.73 (Cloxacillin) (Josamycin) (Sulfadimidine) (Marbofloxacin) 萘夫西林 1.15 白霉素 11.03 磺胺甲氧哒嗪 4.19 二氟沙星 0.84 (Nafcilin) (Sineptina) (Sulfamethoxypyridazine) (Difloxacin) 氟氯西林 2.35 林可霉素 1.76 磺胺喹恶啉 1.31 丹诺沙星 4.71 (Flucloxacillin) (Lincomycin) (Sulfaquinoxaline) (Danofloxacin) 双氯西林 3.67 克林霉素 1.92 磺胺吡啶 1.36 奥比沙星 0.85 (Dicloxacillin) (Clindamycin) (Sulfapyridine) (Orbifloxacin) 图3.5 ng/mL添加浓度下连续进样6针所得 TIC 叠加色谱图 对于乳及乳品中多抗生素残留的样品前处理需要考虑不同化合物的理化性质，比如其中磺胺类和沙星类抗生素可以采用阳离子交换模式进行样品净化，而β-内酰胺类和四环素类药物则通常采用反相机理的 SPE 柱净化。综合56种药物的理化特性，本文选择乙腈沉淀蛋白后，聚合物材质的反相 SPE 柱通过式净化即药物全部通过不保留，而非极性脂质及部分可溶性蛋白被吸附过滤除去的净化方式。此方式可以最大程度的满足多极性药物的净化及选择。当然这种通过式净化效果的选择性比离子交换选择性强的净化等模式要差一些，但还是一种可以满足多抗生素快速筛查的前处理方式。 结论 本文采用 Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统/6460三重四极杆液质联用系统成功实现了对乳及乳制品中56种抗生素残留量的高灵敏快速确证定量分析。本方法各项参数完全满足对于乳品中药物残留限量检测的要求，并可应用于其他动物源性样品基质中抗生素的快速检测。 ( 参考文献 ) ( 1. 中华人民共和国农业部公告第193号：食品动物禁用的兽 药及其它化合物清单 ) ( 2. 中华人民共和国农业部公告235号：动物性食品中兽药最高残留限量 ) ( 3. 奶业创新团队技术规范 MRT/B 31-2015 ) ( 4 . 孙颖宜等，国内外乳及乳制品中兽药残留限量标准比较分 析.食品安全质量检测学报， 2016(7)：378-382 ) ( 5. 郭军等，乳及乳制品中抗生素类兽药药留快速检测技术.中 国乳品工业，2004(32)：30-35 ) 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线：800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 本文中的信息、说明和技术指标如有变更，恕不另行通知。 安捷伦科技(中国)有限公司，2016 2016年9月6日，中国印刷 5991-7401CHCN Agilent Technologies     本文采用 Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统/6460 三重四极杆液质联用系统建立了 56 种抗生素（包括磺胺、喹诺酮、四环素、-内酰胺、大环内酯、林可胺类等）同时检测的分析方法。牛奶或乳粉经过乙腈沉淀蛋白提取后，经反相固相萃取柱通过式净化后，采用薄壳型填料反相 C18 色谱柱 — Agilent Poroshell 120EC-C18 分离，经配有安捷伦喷射流 (AJS) 电喷雾离子源的安捷伦三重四极杆液质联用系统在正离子模式下监测。该方法在 0.1–200 ng/mL 浓度范围内线性相关性良好，相关系数 R2  0.990；在 5 ng/mL 添加浓度下，各化合物峰面积稳定性在0.40%-14.02% 之间；各化合物仪器定量检测限 (LOQ) 可达到 0.02-2.0 ng/g。通过对方法灵敏度、精密度和线性范围等方法学参数进行考察，得到所建立的方法能在 18 min 内对乳品中 56 种抗生素类目标化合物完成快速、高灵敏度的检测分析，完全满足法规监测要求。    乳及乳制品是指以生鲜牛（羊）乳及其制品为主要原料，经加工而制成的各种产品，其已成为人们非常喜爱的日常食品之一。随着全球经济一体化和食品贸易国际化，乳及乳制品的质量安全已成为世界性的挑战和全球重要的公共卫生问题。其中兽药残留问题是影响其安全的最重要的因素之一。兽药是指用于预防、治疗、保健、诊断动物疾病或者有目的调节动物生产性能的药物及其制品，可以有效控制动物的疫情，提高动物的存活率，保证养殖业的健康发展。如果使用不当或者非法使用药物，过量的药物就会残留在动物体内，当人食用了兽药残留超标的动物性食品后，就会在体内积蓄，产生过敏、畸形、癌症等不良后果，直接危害人体的健康甚至生命。