肉及肉制品中亚硝胺检测方案(气质联用仪)

一.方法包简介 三.化合物简介 亚硝胺检测的整体解决方案以及方法包介绍 图网 nipic.com/ 赛默飞世尔科技 三重四极杆串接气质 目录 一方法包简介 4 二.仪器简介 5 三.化合物简介 6 四.相关政策及法规 7 五.仪器和设备 7 六.样品前处理方法 8 七.方法包使用简介 10 八.应用文章 14 方法包是赛默飞世尔科技色谱质谱部应用部门针对客户需求提出的简易仪器使用流程，方法包内所涉及的化合物均为常见的能在 GC/MS 上检测的化合物，如农药残留、多环芳烃、多氯联苯、多溴联苯和多溴联苯醚、邻苯二甲酸酯等。方法包的作用就是能使客户更快更简便地使用仪器，尽快上手。 方法包包括进样方法、数据处理方法(TraceFinder 方法文件夹)、相关应用文章、相关标准、色谱柱信息、前处理方法、数据文件等，客户可以直接调用进样方法和数据处理方法完成化合物的定性定量分析。 由于 Thermo ScientificMTSQ 8000 Evo 采用 T-SRM 进样方法而不是分时间段的扫描方法，原来的进样的方法可以直接调用，即使保留时间会有微小的偏差，也不会影响最终的结果。另外， TraceFinder 软件自带的数据库可以直接编辑数据处理方法，数据库里包括化合物的名称、离子对、碰撞能量、定量离子、定性离子、CAS号等信息。同时， TraceFinder 软件可以根据数据处理方法自动关联生成 TSQ 8000 Evo 的方法文件。这样应用 TraceFinder 就可以直接生成数据处理方法和进样方法。整个过程都是自动化的，几乎不需要操作者手动输入任何操作信息。 方法包(Method Kit ) 对于常用分析化合物，：我们可以提供方法包。 包括：邻苯二甲酸酯、PCB、PAH、PBDE、农残筛查、GB2763、烟草中农残、PM2.5、香港规管方案、药典中农残检测、亚硝胺、二恶英等。 目的： 二.仪器简介 TSQ 8000 Evo 三重四极杆串接气质联用仪 秉承着在气相色谱三重四极杆质谱中技术的一贯领先优势， Thermo Fisher Scientific 在推出 TSQ 8000 之后再次创新，推出了更新的一款气相串接质谱仪 TSQ 8000 Evo， 该款高效的 GC/MS/MS 提供了永不停机的生产率，其出色的灵敏度，超快的扫描速度，简便的 MS/MS功能，满足最苛刻的定量定性分析要求，为食品安全、环境分析、法医和制药应用分析提供基础。 TSQ 8000 Evo 主要特点： 。 AutoSRM 功能自动优化二级离子对信息。 ·定时保留时间 SRM 功能 (T-SRM)和定时保留时间 SIM 功能(T-SIM)使高通量检测成为可能，并且优化方法设置参数，无需分配时间段。 。最新的 TraceFinder 软件，提供最新的技术平台，界面友好的色谱分析软件，可以直接调用数据库信息自动建立数据处理方法及进样方法。 ·高达800 MRM/s的扫描速度，即使在极限高速扫描条件下仍不会过多损失灵敏度。 在质谱不泄真空的情况下，更换整个离子源，节省常规系统维护时间，简化操作。 ·双灯丝设计，并且灯丝在同一侧。 离子源上具有双加热区，有效去除基质对离子源的污染，节省维护时间。 ·弯曲的预四极杆，有效去除中性噪音，减少背景并提高灵敏度。 ·方法桥，，可以读取 Thermo Scientific'M ISQ 单四极杆气质联用仪的方法或者其他公司的 SRM 方法。 N-亚硝胺物质是国际上公认的一类强致癌物，其化学式常写作R，N-NO，在大气、水、土壤、食品、烟草、化工产品、农药和药物等人类环境介质中广泛存在。 食物中的亚硝胺主要是由亚硝酸生成的。亚硝酸通常作为防腐剂被添加到肉及肉制品中，以避免肉毒杆菌造成的中毒。亚硝胺的另一个来源是由氮的氧化物与生物碱反应产生，这一反应在啤酒生产时干燥已萌发的麦芽的过程中已有报道。在熏腊食品中，同样含有大量的亚硝胺类物质，某些消化系统肿瘤，如食管癌的发病率与膳食中摄入的亚硝胺数量相关。另外，在食品接触类橡胶制品中，也含有大量的亚硝胺物质。下表列举了食品和化工产品中通常存在的一些亚硝胺。 表1：食品和化工产品中常检测的亚硝胺 编号 缩写 英文名 中文名 CAS No. 1 NDMA N-Nitrosodimethylamine 二甲基亚硝胺 62-75-9 2 NEMA N-Nitrosomethylethylamine N-亚硝基甲乙胺 10595-95-6 3 NDEA N-Nitrosodiethylamine 二乙基亚硝胺 55-18-5 4 NDPA N-Nitrosodi-n-propylamine 二丙基亚硝胺 621-64-7 5 NDBA N-Nitrosodibutylamine N-二正丁基亚硝胺 924-16-3 6 NMPhA N-Methyl-N-nitrosaniline N-甲基-N-亚硝基苯胺 614-00-6 7 NEPhA N-Ethyl-N-phenylnitrosamine N-亚硝基-N-乙基苯胺 612-64-6 8 NPIP N-Nitrosopiperidine N-亚硝基哌啶烷 100-75-4 9 NPYR 1-Nitrosopyrrolidine N-亚硝基吡咯烷 930-55-2 10 NMOR N-Nitrosomorpholine N-亚硝基吗啉 59-89-2 11 NDPhA N-Nitrosodiphenylamine N-亚硝基二苯胺 86-30-6 12 NDiNA N-nitrosodiisononylamine N-亚硝基二硝基苯胺 1207995-62-7 13 NDiPA N-nitrosodiisopropylamine N-亚硝基二异丙胺 601-77-4 14 NDBzA N-nitrosodibenzylamine N-硝基联苄基胺 5336-53-8 四.相关法规及政策 美国环境保护局(USEPA)认为 N-亚硝基二甲胺(NDMA)在极低的浓度(0.7 ng/L)下就会致癌，已将其列为优先控制污染物。许多国家及国际组织都对相应制品中N-亚硝基胺的检测制定了严格的标准，如中国出台了 GB 28482-2012《婴幼儿安抚奶嘴安全要求》中氮亚硝胺的释放量为 0.01mg/kg； 欧盟《玩具安全新指令》(2009/48/EC)中，对其中的N-亚硝基胺含量及迁移量有着极为严格的规定，其总亚硝胺的迁移量也不得高于 0.05 mg/kg，总可亚硝化物质(即亚硝胺前体物)的迁移量不得高于1mg/kg。同时，与该指令配套的欧盟协调标准 EN71-12要求至少检测13种N-亚硝基胺，包括脂肪族亚硝胺、脂环族亚硝胺及芳香族亚硝胺等。 关于食品中的亚硝胺限量，我国的 GB 2762-2012《食物中污染物限量标准》规定肉类及肉制品中二甲基亚硝胺限量为 3 pg/kg，水产制品中的限量标准为4 pg/kg。 五.仪器和设备 仪器： Thermo ScientificM TSQ 8000 Evo 气相色谱三重四极杆串接质谱仪。 色谱柱： TG-5 MS ( 30 m*0.25 mm*0.25 um)毛细管色谱柱 (Thermo Fisher Scientific)。C10保留时间为 17.26 min。 六.样品前处理 关于亚硝胺的前处理，不同基质可以采取不同的前处理，下面列举几种常用的前处理方法： 1.按照 GB/T 5009.26-2003《食品中N-亚硝胺类的测定》的前处理方法： 1.1提取(水蒸馏装置蒸馏) 200g(精确至 0.01 g) 试样，加入 100 mL 冷凝液后关闭加热装置，停止蒸馏； 1.2萃取净化 将二氯甲烷萃取液用 10 g 无水硫酸钠脱水后， 进行旋转蒸发； 于40℃水浴上浓缩至 5-10 mL 改氮吹； 准确定容至 1.0mL， 摇匀后待测定。 2.啤酒中的亚硝胺前处理方法：按照 AOAC官方方法(2000)，982.11并略有改动，使用 Celite 硅藻土柱并用 DCM系统的固相萃取方法来分离亚硝胺。 3.橡胶材料中的亚硝胺前处理方法： 3.1样品提取 准确称取 5.00 g (精确到0.01g)样品于 40 mL 棕色玻璃瓶中，加入30 mL 甲醇，室温温声萃取 30 min； 过滤转移溶液至 250 mL 平底烧瓶中，加入20 mL 甲醇溶剂，重复超声和转移步骤，并用少量甲醇洗涤棕色瓶2-3次，合并两次超声和洗涤溶液； 将溶液旋转蒸发(35℃，150 mbar ) 至 4 mL 左右，于涡旋混匀器上充分旋转振荡 1 min， 样品溶液转移至 10 mL 具塞离心管中； 另取1mL 甲醇分 2-3 次洗涤平底烧瓶壁，并于涡旋混匀器上充分旋转振荡1min， 合并洗涤液于 10 mL 具塞离心管中。 3.2净化 C18 固相萃取小柱置于固相萃取装置上，用5 mL 甲醇预淋洗Ｃ 18小柱； 3.3浓缩 样液于 250 mL 的平底烧瓶中，并用少量甲醇淋洗离心管壁2-3次，合并洗涤液于平底烧瓶中； 将溶液旋转蒸发(35℃，150 mbar ) 至 4 mL 左右，取下平底烧瓶，于涡旋混匀器上充分旋转振荡 1 min； 然后将平底烧瓶中的样液转移溶液至 5 mL 棕色容量瓶中。用少量甲醇淋洗平底烧瓶2-3次，并于涡旋混匀器上充分旋转振荡1 min， 合并洗涤液于棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度； 经0.45 u m 滤膜过滤进进行分析。 七.7方法包的使用 1.进样方法使用： 直接使用方法包中 meth 结尾Nitrosamine 的文件，进行进样分析。 不同仪器配置可能稍有不同，可以参考以下方法截图。 2.数据处理方法建立：直接拷贝方法包中的文件夹 Nitrosamine 到C：\TraceFinderData\32\Methods 或者 C：\TraceFinderData\3.3\Methods 中(根据自己 TraceFinder 的版本寻找相对应的路 径)，方法就可以直接在 TraceFinder 软件中打开，这个方法包括数据处理方法和进样方法。 3.将步骤1中的进样方法拷贝粘贴到 C：\TraceFinderData\InstrumentMethods 中， 在 InstrumentMethods 中选择这个文件，然后保存这个 TraceFinder 的 Master Method。 4.将按照步骤1进样完成的数据文件与 TraceFinder 方法相关联，得到完整的数据处理方法。按需要更改保留时间等参数进一步对数据处理方法进行优化，得到准确的数据处理方法。整个过程无需输入化合物信息，离子对信息，挑选离子对信息找到化合物，所有的步骤均是自动完成，一点即可，极大得提高分析效率，简化方法流程。 最终只需要再输入定量的标准曲线各浓度点和具体浓度即可完成数据处理方法的建立。 利用气相色谱-质谱/质谱联用仪进行高灵敏度的亚硝胺分析 Alex Chen1， Hans-Joachim Huebschmann?， Li Fangyan， Chew Yai Foongand Chan Sheot Harn3 1Alpha Analytical Pte. Ltd.， Singapore； 2Thermo Fisher Scientific，Singapore， 3Health SciencesAuthority， HSA Singapore 亚硝胺；食品安全；啤酒； TSQ 8000；气相色谱-质谱/质谱；定量分析；确认；自动 SRM； TraceFinder 简介 亚硝胺是N-亚硝基烷基胺一类化合物的通用名。已知的含有不同烷基基团的这类化合物有很多。最简单的 N-亚硝基烷基胺含有两个甲基，即N-亚硝基二甲基胺(NDMA)。亚硝胺是常见的剧毒化合物，对人和动物都有强致癌性，高剂量的摄入会导致严重的肝损伤和内出血。 食物中的亚硝胺注要是由亚硝酸生成的。亚硝酸通常作为防腐剂被添加到肉及肉制品中，以避免肉毒杆菌造成的中毒。维生素等有抗氧化作用的添加剂能抑制亚硝酸向亚硝胺的转化。亚硝胺的另一个来源是由氮的氧化物与生物碱(alkaloids)反应产生，这一反应在啤酒生产时干燥已萌发的麦芽的过程中已有报道。由于麦芽和啤酒中的亚硝胺水平在发酵过程中已大幅降低，需要更好的分析表现才能胜任此检测任务。而除了其它各项日常食品的常规控制项目之外，啤酒中麦芽的低剂量亚硝胺检测也是必须的。 已采用多年的“经典”亚硝胺检测方法是利用串接热能分析仪(TEA)检测器的气相色谱进行分析的。选择特殊的 TEA 检测器是由于该检测器能够从亚硝胺生安 NO， NO 又能与臭氧进行特异性的化学发光反应，从而实现特异性的亚硝胺检测。而如今，随着对检测方法的灵敏度的要求不断增加， TEA 的检出限及其复杂的操作程序，已无法满足目前的低检出限和高样品通量要求。质谱仪已在不断取代 TEA。 由 Munch 和 Bassett于2004年建立的EPA 方法521提供了一个适应当时要求的、基于化学电离(CI)和带有内部离子 化功能的离子阱质谱仪的气质联用检测方法，而不是标准的带有外部离子源的四极杆或离子阱质谱仪。如今随着技术的发展， GC-MS三重四杆杆也可以在低分子量区域提供高灵敏度和高选择性的分析，使得非常低浓度的亚硝胺检测，甚至是在复杂样品中的低浓度检测，成为可能。这一可能性源于使用更为简便的、利用常规的电子轰击源(EI)的标准技术，来建立低浓度亚硝胺检测的便捷方法。 本应用说明文章描述了一套完整的、使用 GC-MS/MS 进行食品中亚硝胺类化合物常规检测和定量的方法。本工作中的食品基质包括多种不同的麦芽啤酒产品以及作为最终食品产物销售的啤酒本身。在方法开发过程中，我们特别注意优化，以在达到对亚硝胺化合物检测所需的高灵敏度的同时，提供一种迅速、易于实现的常规检测方法。 样品处理方法基于 AOAC 官方方法(2000)，982.11并略有改动。我们建立了一种使用 Celite 硅藻土柱并用 DCM 洗脱的固相萃取方法来从啤酒样品中分离亚硝胺。 GC-MS/MS仪器 TRACE 1310 GC iC 进样模块 分流/不分流进样口 进样器温度 250℃ 进样模式 不分流 加压模式 300 KPa 不分流时间 1.0分钟 分析柱 TG-WAXMS， 30 mx0.25 mmx0.5 um 载气 He(99.999% purity ) 流速 1.0 mL/min， 流速不变 柱温箱程序 45℃3 min， 25℃/分至130℃， 12℃/分至230℃，保持1 min 传输线温度 250℃ 总分析时间 14.7分钟 总循环时间 18.4分钟 TriPlus RSH 自动进样器 进样体积 1pL 溶剂 二氯甲烷 标准运行程序 每个样品重复进样3次 标准溶液稀释 1 ppb， 5 ppb， 10 ppb， 25 ppb， 100 ppb，250 ppb， 500 ppb 内标 每次加入50 ppb NDPA 表1.AutoSRM 生成的 SRM 方法设置 TSQ 8000 三重四极杆 GC-MS/MS 系统 离子化模式 EI 质量分辨率设定 正常 源温度 220℃ 扫描模式 SRM， 基于保留时间的 SRM 模式 SRM 方法建立 我们使用了 Thermo Scientific TSQTM 8000 GC-MS/MS 软件套件中的AutoSRM 软件进行了三重四极杆质谱方法的建立，且并未对 AutoSRM 生成的方法进行任何手动修改。一个装有待分析亚硝胺化合物标准品溶液的自动进样器样品瓶专供AutoSRM 程序使用。 AutoSRM 程序自动进行以下三个步骤： 1.首先对标准品溶液进行全扫描分析(图1.)。从全扫中得到的信号最强的离子将被作为一级离子。 2.对上一步确定的一级离子(母离子)进行二级离子(子离子)谱图获取(可以根据分析需求设定一级离子的个数)。找出每个一级离子产生的信号最强的二级离子(可以手动选择最感兴趣的一级离子进行进一步优化)。 Precursor Product Collision Energy (eV) Retention Time (min) Time Window (min) NDMA 74 42.1 15 7.89 1 74 43.8 5 7.89 1 NDEA 102 44.1 10 8.56 1 102 85.1 5 8.56 1 NDPA (ISTD) 130 42.9 10 9.76 1 130 113.1 5 9.76 1 NDBA 158 99.1 5 11.35 1 158 141.1 5 11.35 NPIP 114 41.5 151 1.80 1 114 83.9 5 11.80 1 NPYR 100 43 10 12.06 1 100 55.1 5 12.06 1 NMOR 116 56.1 10 12.47 1 116 86.1 5 12.47 1 3.对所有化合物的选定的母离子/子离子对进行碰撞能的优化，以获得最大化合物响应及最佳方法灵敏度(图2)。 AutoSRM 程序能够根据需要从一个标准品样品瓶启动，完成所需的进样次数。 表1就是由 AutoSRM 自动生成的 SRM 离子对表格。该表同时还显示了 TSQ 8000 GC-MS/MS 在 Timed-SRM 模式下、在化合物洗脱时间左右用一个60秒的短采集窗口进行采集的SRM 采集方法。无需对扫描时段进行任何其他的设置，或者说如果需要在某化合物的洗脱时间之外对其进 行监测，则需要手动添加该化合物。 样品测定 在大量各种可能的亚硝胺化合物之中，本方法涵盖了那些被报道与发芽麦芽干燥的过程相关的亚硝胺化合物。被分析的样品包括未添加标样的麦芽啤酒样品，以及作为空白样的4% Z醇。如需对其他食物基质进行分析，其它化合物可以随时参照前述 AutoSRM 方法建立的步骤添加至本方法中。 本方法中包含的亚硝胺类化合物的色谱呈现了较快的流出，从7.87的NDMA到12.47分，能够实现较短的循环时间并提高样品通量。图3显示了用校准曲线中的最低浓度1 ppb的样品得到的峰强度。从图中可见 NDMA 检测的信噪比依然很好。 图 1.AutoSRM 对 NDMA从El全扫谱图中进行及级离子选择 图2. AutoSRM 对所有亚硝胺一级离子进行碰撞能优化 cc一 我们在 1 ppb 到500 ppb 这一较宽的浓度范围内进行了定量校准。图4展示了从所有的校准检测中得到的亚硝胺色谱峰。在所有情况下， NDMA 的峰形都是完全对称的，没有拖尾，而且无需任何手动修正就得到了非常可靠的峰面积积分值。图5所示为用于样品定量的 NDMA校准曲线，曲线R?大于0.99， 可见线性极佳。本 TSQ 8000 GCMS/MS 方法对所有亚硝胺都达到了相同水平的校准精度。 图4. NDMA从 1 ppb(底部)至500 ppb(顶部)的校准曲线测定结果 图5. NMDA 从 1 ppb 到 500 ppb 的校准曲线 LOQ 测定 最低定量限(LOQ)和最低检出限(LOD)的计算都基于色谱峰的信噪比。LOQ的计算基于的信噪比为10， LOD 基于的信噪比为3。 表2.本方法LOQ 和LOD 的计算 Compound S/N@1ppb CalculatedLOQ (ppb) CalculatedLOD (ppb) NDMA 13 1.0 0.25 NDEA 231 0.05 0.02 NDBA 23 0.5 0.20 NPIP 10 1.0 0.50 NMOR 40 0.3 0.10 NPYR 24 3 1.0 化合物确认是通过 Thermo Scientific TraceFinderTM 定量分析软件提供的离子比检查功能实现的，该功能比较了用于定量的SRM 与定性 SRM 的离子强度。覆盖 1 ppb 到500 ppb 浓度区间的标准品被进行了三次重复进样检测并用于计算离子比的精确度，结果显示在表3中。虽然所有被检测的离子都处于低质量数范围并可能受到多种干扰，二级离子的离子比的精确度-直很好的保持在1-4% 为了在样本分析中进行质量控制，在用 TraceFinder 软件进行定量数据处理时，阳性结果都会通过离子比检查进行确认。对所有化合物来说，采集的两个二级离子的离子比例需保持在±5%(10%)范围内，符合从标准品得到的校准值。这为常规的样品检测提供了坚实的安全保障。表3列出了所有本研究中涉及到的亚硝胺的平均离子比值。 我们对多种样品进行了检测，包括空白样和添加了标准品的啤酒样品等。空白样的检测结果如表44所示。该样品中检出的低浓度 NDMA 经计算发现低于校正曲线浓度，也低于 LOQ。故在此LOQ下，空白样品可以被确认为不含亚硝胺化合物。 另一个样品通过在啤酒中添加不同浓度的亚硝胺制备而成。所有的亚硝胺化合物都被检出，并在低浓度区间进行了定量，如表5所示。每个用于定量的峰都通过了离子比质量控制，并且能够在这样的低浓度通过计算离子比对每个检测为阳性的化合物进行确认。 通过本文描述的基于 TSQ 8000 系统的 GC-MS/MS 方法，所有研究涉及的亚硝胺化合物都能在食品安全控制所要求的低浓度被安全地检出并实现精确的定量。 在定量校正曲线所用的最低浓度为 1 ppb 的情况下，所有化合物的 LOD 都低于 1 ppb。 TSQ 8000 GC-MS/MS 在 1-500 ppb 的范围内显示出宽广的线性区间和优异的准确度。所有校正曲线的线性都非常好，R?大于0.99。 TSQ 8000 GC-MS/MS 也显示出非常好的离子比稳定性，适用于阳性样品的确认。所有化合物的离子比，哪怕是在 LOQ 浓度下，RSD%都低于4%。 基于 GC-MS/MS 的亚硝胺检测方法的使用、建立，以及维护都很简单。哪怕是在分析新的未知物时，我们独有的 AutoSRM软件也能够自动找出并优化 SRM 离子对和碰撞能。 基于本文所示的 GC-MS/MS 方法， TSQ 8000 GC-MS/MS 能够准确可靠地测出真实样品中的亚硝胺含量。 本文所述的利用 TSQ 8000 GC-MS/MS 进行食品中的亚硝胺检测的 GC-MS/MS 方法可以直接用于常规的食品安全控 制。本方法使用的标准 GC-MS/MS 三重四极杆仪器也被广泛应用于常规食品安全控制的其他领域，例如杀虫剂、POPs，或多环芳烃。本方法检测迅速，能够支持高样品通量，并且提供的结果具有非常高的灵敏度和精确度。 本方法使用常规的电子轰击源进行离子化并实现低浓度的亚硝胺定量，我们推荐将本方法作为前述使用液态CI试剂的化学离子化的离子阱方法的高产出的替代方案。 表3.从1 ppb-500 ppb 的确认离子比的精确度 Concentration (ppb) 1 5 10 25 100 250 500 AVG RSD(%) NDMA 70.7 67.9 68.0 69.8 69.1 71.9 69.6 69.6 2.01 NDEA 20.8 22.1 22.5 22.4 22.5 22.5 22.5 22.2 2.84 NDBA 102.4 102.4 98.2 98.6 96.1 93.4 99.2 98.6 3.28 NPIP 6.1 5.5 6.2 5.9 6.0 6.1 6.2 6.0 3.88 NPYR 一 64.6 62.4 66.2 66.9 68.1 66.7 65.8 3.06 表4.空白样品检测结果 Compound Area ISTD Area Area Ratio lon Ratio Confirmation Calculated Amount (ppb) NDMA 2591.368 2028129.842 0.001 Pass (65.1%) 0.74* NDEA 1875.386 2028129.842 0.001 Fail (0%) N/A NDBA 6806.996 2028129.842 0.003 Fail (81.1%) N/A NPIP N/A 2028129.842 N/A N/A N/A NPYR N/A 2028129.842 N/A N/A N/A NMOR 4415.782 2028129.842 0.002 Fail(0%) N/A 表5.添加标准品的啤酒样品检测结果 Compound Area ISTD Area Area Ratio lon Ratio Confirmation Calculated Amount (ppb) NDMA 91318.135 2282168.009 0.040 Pass (68.3%) 12.0 NDEA 480955.478 2282168.009 0.211 Pass (22.0%) 9.4 NDBA 402754.561 2282168.009 0.176 Pass (96.8%) 13.2 NPIP 280162.125 2282168.009 0.123 Pass (5.9%) 10.1 NPYR 318081.273 2282168.009 0.139 Pass ( 68.9%) 13.3 NMOR 1145719.054 2282168.009 0.502 Pass (67.9%) 10.1 ( 参考文献 ) ( [1] Robert K. Boyd， Cecilia Basic， Robert A . B ethem， T r aceQuantitativ e Analysis by Mass Spectrometry ， 2008 JohnWiley & S ons， Ltd. ) ( [2] Materia l Safet y Data Sheet NDMA. ) ( [3] Agency f or Toxic S ubstances & Disease Re g istry， PublicHealth S tatement for n-nitrosodimethylamine， 19 8 9， http：//www.atsdr.cdc.gov/toxprofiles/phs141. ht m l. ) ( [4] Richard A. Scanlan， Nitrosamines and Cancer， Linus Pa u linginstitute， http：//lpi.oregonstate.edu/f-w00/nitrosamine.html. ) ( [5] Mario M. Mangino a nd Richard A. Scanlan， N -Nitrosaminesin Beer ， N-Nitroso Compounds， ACS Symposium Series，Vol.174， 1981， Chapter 17， 229-245. ) ( [6] Munch， J.W.， Bassett， M.V. Method 521： Determination ofnitrosamines in drinking water by s olid phase extractionand capillar y column gas chromatography w ith l argevolume i njection and chemical ionizati o n tande m massspectrometry (MS/MS) ( Version 1 .0) U.S. EnvironmentalProtection Agency. ) ( [7] Raymond E. March， Richard J. Hughes， Quadrupole StorageMass Spectrometry，2nd Ed.， John Wiley & Sons 1989. ) ( [8] AOAC Official Method 982.11，2000. ) ( [9] Introducing AutoSRM， Thermo Fi s her Scientific， T echnicalBrief No . AB52298， 2012. ) ( [10] Thermo Scientific TSQ 8000 Triple Quadrupole GC-MS/MS Instrument Method， Thermo Fisher Scientific， Technical Brief No. AB52299，2012. ) TSQ 8000 Evo 检测橡胶及弹性体材料中11种亚硝胺 李春丽彭兴 赛默飞世尔科技(中国)有限公司 前言 N-亚硝基化合物是一类很强的化学致癌物质，包括亚硝胺和亚硝酰胺两大类物质，通常泛称为亚硝胺。超过300多种N-亚硝基化合物在一种或多种动物身上显示出具有致癌作用，并且40多种动物包括灵长类都是易于感染N-亚硝基化合物而引起癌症，而且这类强致癌物质在实验动物体上诱导出的肿瘤在形态学特点与生化特点上都与相应的人体器官上发现的肿瘤相似②。美国环境保护局(USEPA)认为N-亚硝基二甲胺(NDMA)在极低的浓度(0.7 ng/L)下就会致癌，已将其列为优先控制污染物③。许多国家及国际组织都对相应制品中N-亚硝基胺的检测制定了严格的标准[4J5]6]，如中国出台了 GB28482-2012《婴幼儿安抚奶嘴安全要求》；欧盟《玩具安全新指令》(2009/48/EC)中，对其中的N-亚硝基胺含量及迁移量有着极为严格的规定。同时，与该指令配套的欧盟协调标准 EN 71-12要求至少检测13种N-亚硝基胺，包括脂肪族亚硝胺、脂环族亚硝胺及芳香族亚硝胺等。 1.实验部分 1.1仪器和试剂 质谱仪： TSQ 8000 Evo质谱仪(赛默飞世尔科技，美国)； 气相色谱仪：Trace 1310气相色谱配Al 1310 自动进样器(赛默飞世尔科技，美国)； 因此开发出快速、灵敏和准确的N-亚硝胺化合物的测定方法，对卫生检测、削减和控制亚硝胺含量的研究是迫切需要的。使用 GC-MS/MS 检测 N-亚硝胺，已有一定程度的应用T。赛默飞世尔科技的串接气质联用 TSQ 8000 Evo 有有高灵敏度、背景干扰小、稳定性高等特点。本文以 TSQ 8000 Evo 为平台建立了橡胶及弹性体材料中11种N-亚硝基胺 GC-MS/MS 检测方法，结合赛默飞世尔科技特有的 TraceFinder 软件系统进行数据采集、数据分析和报告输出，实现了数据的快速采集及数据结果的智能处理。为N-亚硝基胺的痕量检测提供了强而有力的技术支持。 色谱谱： TR-5 MS (30mx0.25 mmx0.25 pm) 毛细管色谱柱； 试剂：正己烷，丙酮，甲醇；均为色谱级 1.2实验方法 1.2.1气相方法 程序升温：35℃(维持3min)，10 ℃/min 到100℃(维持1 min)， 25 ℃/min 到250℃(维持3min)进样口温度： SSL分流不分流(220℃) with Splitless 不分流模式 载气流速：1.0mL/min(恒流) 质谱运行时间：19min 传输线温度：2250 扫描方式： Timed-SRM 进样体积：1.0pL 碰撞气压力：1.0mTorr氩气 1.2.2质谱方法 SRM 条件见下表： 11种N-亚硝基胺化合物及1种内标物质质谱信息 1.3样品制备 样品制备成2mm×2mm×2 mm 大小(均匀取样)。 1.4样品前处理 1.4.1样品提取 准确称取5.00 g(精确到0.01g)样品于40 mL 棕色玻璃瓶中，加入30mL甲醇，于室温超声萃取 30 min ， 过滤转移溶液至250mL 平底烧瓶中；再向样品中加入20mL甲醇溶剂， 重复超声和转移步骤，并用少量甲醇洗涤棕色瓶2-3次，合并两次超声和洗涤溶液；将溶液旋转蒸发(35℃，150 mbar)至4mL 左右，于涡旋混匀器上充分旋转振荡 1 min，样品溶液转移至10mL具塞离心管中。 另取1mL 甲醇分2-3次洗涤平底烧瓶壁，并于涡旋混匀器上充分旋转振荡1 min， 合并洗涤液于 10 mL 具塞离心管中。 将C18固相萃取小柱置于固相萃取装置上，用5mL甲醇预淋洗 C18 小柱。将样液注入小柱，流出液收集于离心管中，待样液液面下降至小柱填料的上层面时，再加入5mL甲醇进行洗脱，收集合并全部流出液于离心管中。 1.4.3浓缩 样液于250mL的平底烧瓶中，并用少量甲醇淋洗离心管壁2-3次，合并洗涤液于平底烧瓶中，将溶液旋转蒸转(35℃， 150mbar)至 4mL左右，取下平底烧瓶，于涡旋混匀器上充分旋转振荡1 min， 然后将平底烧瓶中的样液转移溶液至5mL 对于大部分常见化合物方法信息，已包含在F7TraceFinder 内置数据库中。检测所涉及的化合物的质谱方法信息可使用TraceFinder 通过 Database 进行查询、编辑、提取并可直接导入仪器方法中使用。这些化合物包括农药、多环芳烃、多氯联苯、多溴联苯和多溴联苯醚、邻苯二甲酸酯等常见关注化合物。 2.2 使用 AutoSRM 软件自动优化化合物信息 对于11种N-亚硝基化合物及1种内标物质，在方法建立初期，其色谱质谱条件未知，需要对其相应的色谱、质谱方法优化。同样可以利用 TSQ 8000 系列产品所特有的 AutoSRM 软件进行自动优化，可实现优化后自动生成仪器方法的功能。 AutoSRM 程序自动进行以下三个步骤：1.全扫描分析。通常 最强的离子将被作为母离子。2.对母离子进行子离子全扫。信 号最强的子离子。3.对选定的母离子/子离子对进行碰撞能的优化。其工作流程如图2所示。 2.3定性结果 实验采用的 TR-5MS 色谱柱对N-亚硝化化合物有良好的分离效果，12种化合物(含1种内标物质)在19 min 的分离时间内得到了良好的色谱图，结果如图3所示。 图2.AutoSRM 工作流程 C：\Users\...\HK-Nitrosamine\0221\50ppb 02/21/13 16：14：18 2.3方法回收率及仪器稳定性 选取4种物质(NDPA，NDEA， NDBA， NMphA)配置成混合标准品，考察前处理方法的准确性及回收率。根据欧盟农残方法准则要求，回收率需在70-120%之间。实验以 100 pg/kg 浓度水平进行添加回收实验，测定两组平行样品，结果如表1所示。结果表明，回收率均处于70-120%之间，方法准确性良好。 同时对仪器的稳定性进行了考察，将4种化合物配置成5.0 ug/kg标样，连续进样6次，得到相对应的每个目标化合物的相对标准偏差 (RSD)，测试仪器的稳定性，如表1所示。4种化合物的 RSD 均小于5.0%。结果表明：仪器在低浓度水平(≤5ug/kg)连续进样时，仪器稳定性良好，满足痕量检测需求。 表1.回收率实验结果 NDPA NDEA NDBA NMphA 回收率-1 104.9% 117.6% 120.8% 118.3% 回收率-2 80.3% 114.9% 116.7% 100.0% RSD 2.88% 2.49% 2.66% 1.86% 2.4方法灵敏度、检出限及实际样品测定 TraceFinder 软件可同时实现数据采集及数据处理，根据预先设定的定性离子及定量离子，对化合物的检出结果进行快速、自动化处理，同时实现定性及定量功能。图4为NDPA 质谱图信息。 按照上述前处理方法对实验样品进行处理，以空白样品基质制备浓度为0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、20、50 pg/kg 的基质标准曲线，在确定的色谱和质谱条件下进行测定，对测定结果进行分析，研究方法的灵敏度及检出限。同时选取了两种市售产品(婴儿奶嘴及玩具气球)，对其中11种N-亚硝胺化合物进行了测定。 TSQ 8000 Evo 具有灵敏度高和抗干扰能力强的特点，所检测11种化合物在较低的浓度水平得到了良好的检出效果，完全满足法规要求，如表2所示。同时，在两种实际样品中均检出了少量的 NDBA 残留。结果如表3所示。 2.4结论 实验结果表明 TSQ 8000 Evo 在检测含有痕量亚硝安样品时，具有高选择性、高灵敏度、高稳定性和高通量，在有害化合物检出方面具有优异的表现。同时，强大的 TraceFinder 软件集数据采集、处理，方法开发于一体。在简化实验操作步骤的同时，实现了对数据处理的自动化。 TraceFinder 自带的 AutoSRM软件，对于未知信息化合物的质谱条件的优化开发，提供了可靠的支撑。 图4.NDPA质谱图信息(2pg/kg) 商品类型 亚硝胺 亚硝胺化合物 由弹性材料制造，适用于36个月以下儿童使用的玩具和玩具部件 ≤0.05 mg/kg ≤1 mg/kg 由弹性材料制造，意图放入口中的玩具和玩具部件 ≤0.05 mg/kg ≤1 mg/kg 适用于36个月以下儿童使用的手指画颜料≤ 0.02 mg/kg ≤1 mg/kg 2.66% 1.86% 表3.灵敏度、检出限及实际样品测定结果 化合物名称 保留时间(min) 信噪比(S/N) 检出限(ug/kg) 样品-1(pg/kg) 样品-2(ug/kg) NDMA 4.4 475 0.05 NA N.A NDEA 7.2 35 0.2 N.A N.A NDIPA (ISTD) 9.4 29 0.2 N.A N.A NPYR 10.3 51 0.5 N.A N.A NMPHA 10.3 50 1 N.A N.A NMOR 10.3 45 0.2 N.A N.A NDPA 10.4 21 0.2 N.A N.A NPIP 11.1 24 0.2 N.A N.A NEPHA 11.4 31 0.5 N.A N.A NDBA 13.0 47 11.1 1.1 NDBZA 16.8 12 0.5 N.A N.A NDINA 17.0 86 0.5 N.A N.A 注： “N.A”为未检出 ( [1] R . Preussmann. Carcinogenic N - nitroso compounds and theirenvironmental significance.[M] ) ( [2] Bogovski P . Bogovski S. A ni mal species in w hich N-n i trosocompounds induce cancer[J]. Int e rnational Jo u rnal of Ca n cer，1981，24：471-474. ) ( [3]U.S. Environmental Protection Agency. N-Nitrosodimethylamine( CASRN 62-75-9). http：//www.epa.gov/iris/subst/0045.htm ) [4] GB 28482-2012《婴幼儿安抚奶嘴安全要求》 ( [5]欧盟《玩具安全新指令》(2009/48/EC) ) ( [6]EN 71-12：2013亚硝胺与亚硝胺化合物 ) ( [7]童玉贵，林伟，林中等。气质联用法测定鞋类橡胶材料中的N-亚硝基胺含量[J].皮革科学与工程.2011，5(21)：56- 60. ) ( [8] 李丕，白桦，李海玉等。固相萃取-气相色谱-串联质谱法测定乳胶儿童用品中15种N-亚硝胺及其前体物的迁移量[J]. 色谱.2014，1(32)： 81 -88. ) 更清洁 关于赛默飞世尔科技 赛默飞世尔科技(纽约证交所代码：TMO)是科学服务领域的世界领导者。公司年销售额170亿美元，在50个国家拥有有50，000名员工。我们的使命是帮助客户使世界更健康、更清洁、更安全。我们的产品和服务帮助客户加速生命科学领域的研究、解决在分析领域所遇到的复杂问题与挑战，促进医疗诊断发展、提高实验室生产力。借助于首要生牌 Thermo Scientific、AppliedBiosystems、Invitrogen、Fisher Scientific 和 Unity Lab Services，我们将创新技术、便捷采购方案和实验室运营管理的整体解决方案相结合，为客户、股东和员工创造价值。欲了解更多信息，请浏览公司网站： www.thermofisher.com 赛默飞世尔科技中匡 赛默飞世尔科技进入中国发展已有30多年，在中国的总部设于上海，并在北京、广州、香港、台湾、成都、沈阳、西安、南京、武汉等地设立了分公司，员工人数约3700名。我们的产品主要包括分析仪器、实验室设备、试剂、耗材和软件等，提供实验室综合解决方案，为各行各业的客户服务。为了满足中国市场的需求，现有8家工厂分别在上海、北京和苏州运营。我们在全国共设立了6个应用开发中心，将世界级的前沿技术和产品带给国内客户，并提供应用开发与培训等多项服务；位于上海的中国创新中心结合国内市场的需求和国外先进技术，研发适合中国的技术和产品；我们拥有遍布全国的维修服务网点和特别成立的中国技术培训团队，在全国有超过2000名专业人员直接为客户提供服务。我们致力于帮助客户使世界更健康、更清洁、更安全。欲了解更多信息，请登录网站 www.thermoscientific.cn Orbitrap 组学俱乐部 赛默飞小分子质谱应用技术群 赛默飞世尔科技(中国)有限公司 www.thermoscientific.cn 全国服务热线：8008105118 SCIENTIFIC