全血样品中胆碱含量检测方案(离子色谱仪)

2 王海波 赛默飞世尔科技(中国)有限公司 关键词：胆碱；离子色谱；全血样品 Key words： Choline； ion chromatography； blood 引言 胆碱是一种水溶性B族维生素，在水溶液中以四价铵阳离子形式存在，是正常代谢不可缺少的物质。准确分析全血样品中的胆碱，对于代谢等生物领域具有很重要的作用，是新型反应急性冠脉综合症的指标，在医学领域意义重大。同时胆碱(Choline) 作为一种营养食品添加剂，具有促进大脑的发育、改善大脑的代谢、促进神经系统的信息传递、增强视力、改善钙的代谢等功能。 国标中检测胆碱的方法有GB/T 5413.20-1997《婴幼儿配方食品和乳粉胆碱的测定》2，该方法采用酶水解，分光光度法进行测定，成本高效率低。近年来文献报道食品中胆碱的测定方法为液相色谱法③和离子色谱法[4-6]，液相色谱法一般采用蒸发光散射检测器进行检测，而此检测器非常用检测器，该方法不易推广。离子色谱电导检测器检测灵敏度高，选择性生，易推广，在食品检测方面应用较多，但是应用于全血样品中胆碱的检测鲜有报道。血样不同于常规的食品样品，不易分散。实验室采用曲那通-X100对血样进行分散处理后，采用盐酸水解，离子色谱进行检测。方法简单易行，准确可靠，实验结果满足检测的要求。 测试条件 仪器和试剂 ICS-3000离子色谱系统(美国Dionex公司)，电导检测器；自动进样器及Chromeleon色谱数据处理工作站； MiliQ-Element纯水机(法国Millipore)； KQ-500E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；电热恒温水浴锅(北京长安科学仪器厂)；0.22um尼龙滤膜。 胆碱酒石酸氢盐(纯度98.0%，日本TCI试剂)；MiliQ-Element超纯水；盐酸(优级纯，北京化工厂)；曲拉通X-100(化学纯，西陇化工股份有限公司)；甲烷磺酸(色谱纯， sigma公司)。文中所用血样为鸡血样品。 色谱条件 色谱柱： lonPac CS12分析柱(250mm×4mm) 和lonPac CG12保护柱(50mmx4mm)； 淋洗液：甲烷磺酸(16mmol/L)； 抑制器： CSRS 300 4mm，外接水抑制模式。 进样体体：100uL。 准确称取约2g全血样品(真空采样，保存于4℃冰箱中可保持30天)于50mL具塞玻璃锥形瓶中，加入27.5mL 1.0%的曲拉通-X100溶液，超声15min，再加入1.5mL盐酸，加盖，混匀。将锥形瓶放入70℃水浴3小时，每小时摇一次。将水解产物冷却至室温，用水冲洗锥形瓶，所得溶液过滤至容量瓶中，将滤液定容至100mL， 此滤液可以在4℃下保存三天。分析前用水继续稀释此滤液10倍后，过0.22pm尼龙滤膜。同时准备试剂空白。 结果和讨论 前处理条件的选择 血样不同于粉末的食品样品，凝固后很难在水溶液中均匀分散，会大大的影响提取效率。实验室采用了0.5%曲拉通X-100溶液(一种表面活性剂)对血样进行分散，并且采用超声提取以提高提取率。实验室考察了超声时间(15min、30 min、45 min、60min)对提取效率的影响，从图1可以明显的看出，当超声时间达到15min后，提取率就没有明显的变化，因此实验室选择15min作为超声时间。 图1超声时间对血样检测结果的影响 同时也考察了水解溶液中盐酸的用量，选择某血样，研究采用不同的盐酸溶液配是否会影响血样的水解效率，不同的盐酸配比条件采用实验室建立的方法进行检测，所得结果见表1。 方法1盐酸用量越大，所得滤液酸度较高，若直接进样会使阳离子交换官能团发生质子化，色谱峰严重变形，因此必须再稀释5倍后再进样。而采用方法2和方法3进行前处理，所得滤液酸度就适合直接进样分析，且已经满足了水解的效果。方法3稀释倍数增大一倍，样液中胆碱的含量也能达到检出限的要求，且溶液更容易过滤，可以进一步提高工作效率，所以实验室采用了方法3的盐酸用量进行前处理。 色谱柱的选择 在常用的阳离子色谱柱中， lonPac CS17色谱柱同样可以分析血样中的胆碱，淋洗液浓度为6mM的甲烷磺酸，对于lonPac CS17色谱柱分析奶粉中的胆碱色谱峰对称性更好，所用淋洗液浓度低。但钠离子、铵离子和钾离子的分离度不好，并且lonPac CS17更容易发生阳离子交换官能团的质子化现象，与lonPac CS12A色谱柱相比，前处理后的溶液需要多稀释5倍后进样。可能会影响含量较低的血样的定量。所以实验室采用了lonPacCS12A作为检测用色谱柱，等度淋洗。对于分离效果较好的新的色谱柱来说，淋洗液的浓度不超过20 mmol/L均能满足分离的要求。由于血样中成分较为复杂，钾含量较高，如果淋洗液浓度太高，钾离子拖尾现象比较严重，所以最终采用了16mmol/L作为淋洗液条件。 线性范围和检出限 考虑到血样中的胆碱含量并不是很高，所以对0.02、0.5、1.0、2.0mg/L的范围进行了线性的考察，线性相关系数为0.999，完全能满足定量的要求。以3倍噪 音峰高为检出限，10倍噪音峰高为定量限，按照前处理方法的稀释倍数，胆碱的检出限为10.0mg/kg，定量限为30.0mg/kg. 实际样品分析，加标回收和精密度 本文选择碱含量较低的两个血样进行了测定并做了加标回收实验(n=6)，结果见表2。实际血样在该检测条件下，目标化合物胆碱的周围无杂峰，能准确定量，色谱分离图见图2。同时参照GB/T 5413.20-1997《婴幼儿配方食品和乳粉胆碱的测定》的方法对血样进行检测，检测结果无显著性差异。 图2实际样品的色谱分离图 结论 本方法采用盐酸酸解，使全血样品中的胆碱释放出来，前处理方法对胆碱提取效率高。处理后的样品溶液使用IonPac CS12A色谱柱分析，抑制电导检测，胆碱色谱峰型良好，检测灵敏度高，且可以同时测定其他5种常见阳离子。 表1不同的盐酸配比下胆碱的检测结果 序号 盐酸配比 实际样品含量(mg/kg) 1 2g血样+30mL盐酸溶液，最终定容至500mL 159 2 2g血样+6mL盐酸溶液，最终定容至500mL 162 3 2g血样+6mL盐酸溶液，最终定容至1000mL 158 表2样品测定结果以及加标回收试验(n=6) 样品名称 样品本底含量mg/kg 加标量mg/kg 加标回收率 % 精密度 % 加标量mg/kg 加标回收率 % 精密度% 血样1 50.5 50 95.7 4.5 100 110.3 2.6 血样2 95.4 100 101.2 3.6 200 105.6 3.2 ( 1. Buchman AL， Ament ME， Jenden DJ， et al.Choline deficiency during pa r enteral nutrition inhumans[J]. N utr Clin Pract，2003，18(5)：353-358； ) ( 2. GB/T 5413.20-1997《婴幼儿配方食品和乳粉旦碱的测定》； ) ( 3. 李媛媛，关树文，王伟，张庆波等.食品科学.高效液相色谱法测定婴幼儿配方乳粉中的胆 碱.2009.34(10)：263-265； ) ( 4. 李媛媛，薛静，李刚等；食品科技；离子色谱法测定婴幼儿乳粉中胆碱的含量；2008，3(12)： 267-270； ) ( 5.雒丽丽，王海波，刘汉霞等；分析测试学报；离子色谱法测定乳制品及蜂王浆中的乙酰胆碱； 2011， 30(6)674-677； ) ( 6.贾宏新，李文杰，何小明；中国卫生检验杂志；离子色谱法同时测定食品中胆碱和4中矿物质元 素的含量；2009，19(5)：977-978. ) ThermoFisherSCIENTIFIC Thermo FisherScientific， Austin， TXUSA is ISO Certified.