EphA3+ MSCs细胞中对高浓度的IIIA4有负趋向行为检测方案(实验器材)

细胞趋化实验--EphA3+ MSCs细胞对高浓度的IIIA4有负趋向行为 细胞趋化性(Chemotaxis， 亦被称为化学趋向性)是趋向性的一种，指细胞、细菌及其他单细胞、多细胞生物依据环境中某些化学物质而趋向的运动。趋化性对细胞的发展和其他正常功能一样不可或缺。EphA3在间充质细胞(eMSCs)!中发现表达，但没有在其他的血管连接组织有表达。澳大利亚的科研人员发现在人间充质细胞(MSCs)中表达的EphA3能够在成人血管生成的早期发挥作用。在研究MSCs细胞对于血管生成的信号相应的实验中，研究人员使用过表达EphA3的MSCs处于EphA3的一个“兴奋剂”IIIA4的一个稳定的浓度梯度中，可以观测到过表达EphA3的MSCs对高浓度的IIIA4有负趋向行为。IIIA4是一个能使EphA3活化的抗体，研究表明IIIA4活化EphA3的MSCs减少了细胞间的联系，从而推断出EphA3对于MSCs的定位有着非常重要的作用。 Hypoxia-Controlled EphA33Marks a Human Endometrium-Derived MultipotentMesenchymal Stromal Cell that Supports Vascular Growth C. To， R. Farnsworth， M. Vail， C. Chheang， C. Gargett， C. Murone， C. Llerena， A. Major， A. Scott and P. JanesPloS one， 2014， 10.1371/journal.pone.0112106 一.实验材料准备： 倒置显微镜，具有10X相差物镜和定时拍照功能 . 镜载加热孵育系统(37°℃， 5%CO2) . 可选配置：全自动载物台，自动对焦系统 . 分析软件：手动分析软ImageJ的“Manual Tracking”模块和ibidi公司的“Chemotaxis and Migration Tool”进行数据统计分析。 EphA3+ eMSC细胞 . X-lKd IIIA4抗体 细胞趋化载玻片(图一) (ibidi) 图一， ibidi 细胞趋化载玻片图示，如图所示，细胞种在中间通道，两边的储液池可以放不同的刺激因子，从中间通道的观测可以得到细胞对刺激因子的趋向性，本例是使用一边加入X-lkd IIIA4抗体，另外入边放入培养基作为实验组，两边都放培养基作为对照组。 二.细胞趋化实验 1.实验步骤 将细胞直接加入ibidi细胞趋化载玻片的中间通道中(图二) 图二，在观测通道中加入细胞-基质胶混合液 ● 将细胞趋化载玻片放入培养箱中30-35分钟，等待细胞贴壁 细胞贴壁后分别在两边储液池中加入60pl的X-lkdⅢIA4抗体和无化学趋化物培养基作为细胞趋化实验(+/-) (图三) D 图三：加入X-lkdIIIA4抗体((红色)和无化学趋化物培养基(蓝色) 在两边储液池中均加入60pl的无化学趋化物培养基作为空白对照(-/-) (图四) 图四：加入无化学趋化物培养基(蓝色)作为空白对照 按说明，将通道加液孔塞紧后可以进行图像采集 将载玻片置入镜载加热孵育系统中，调整好采集位点，进行18小时的观测，每20分钟采集一张图片 三.图像数据处理 1.手动细胞轨迹追踪 ● 下载ImageJ，并安装Manual Tracking模块 导入采集的系列图像到ImageJ中，打开模块“Manual1Tracking”， 选择“Addtrack”开始记录细胞轨迹 ● 选择一个细胞，按照时间点单击细胞，第一点击后，会有新窗口跳出来显示初始 位置，以后每次点击，都将在这个新窗口中产生一个该细胞随着时间的新坐标 ● 统计完足够的细胞轨迹后，保存轨迹坐标表格 ● 至少收集30个细胞的轨迹才具有统计学意义，避免同一细胞追踪两次，去除由于凋亡会而不能采集完整的轨迹的细胞 2)全自动细胞轨迹追踪 使用ibidi的WimTaxis自动分析平台，将采集的系列图像上传到该平台，几个工作日后，会得到细胞轨迹的坐标表格数据结果。 四、实验结果： 图五：如图所示，在没有趋化因子存在时，细胞运动没有趋向性，显示出无序性。当X-LkdⅢIIA4抗体存在时，细胞趋向远离X-lkd ⅢIIA4抗体浓度高的区域。具有对X-lkd IIA4抗体的负趋向性。