B细胞受体中钙离子Ca2+成像检测方案(实验器材)

钙离子Ca2+成像--RacPLCy2显著增强了B细胞受体介导的Ca2+活动 在生物有机体内，钙离子传递了各种各样的胞内信号，这些信号几乎在每种类型的细胞中都存在，而且在很多方面都有非常重要的作用。在很多细胞活动的时候，胞内钙离子的浓度会显著升高。钙离子成像是利用钙离子特异染料，将细胞中的钙离子浓度通过荧光强度表现出来，从而达到检测细胞活动的目的。德国的科学家通过研究B细胞胞质中钙离子浓度来研究 Rho GTPase Rac 对于B细胞功能的重要影响，研究发现， RacPLCy2可以通过增强胞浆内的Ca²+浓度来影响B细胞受体 (BCR) 发挥作用。 文中，研究人员用BCR和Ca²+分别处理DT40 Bcell， 观测DT40B cell中钙离子的浓度变化。研究人员研究了在这样的处理下， Unmodified DT40 cells ( PLCy2+/+)， PLCy2-/-cells，PLCyz-/- cells stably expressing wild-type 这几种细胞的钙离子浓度变化，说明了PLCy2，Ca2+和BCR之间的关系。 Rac-mediated stimulation of phospholipase C-gamma-2 amplifies B cell receptor-induced calcium signaling C. Walliser， K. Tron， K. ClauB， O. Gutman， A. Kobitski， M. Retlich， A. Schade， C. Rocker， Y. Henis， G. Nienhaus and P.Gierschik Journal of Biological Chemistry， 2015， 10.1074/jbc.M115.645739 一.实验材料： 1.DT40 B细胞 2.Poly-L-Lysine 0.01%%6((w/v) 3.Fluo-4 AM 2pM 4.Pluronic F-127 0.02%(v/v) 5.RPMI 1640 6.Buffer B 20 mM Hepes/NaOH， pH 7.4；143 mM NaCl； 6 mMKCL；1 mM MgSO4；5.6mM glucose 7.CaCl2 1mM 8.六通道载玻片 无包被，德国ibidi公司，80601 图一： ibidi六通道载玻片，可见载玻片上有六个平行通道，可以做六组平行实验。或者用不同的样本。通道载玻片的特点是单通道容积很小，需要的试剂量只有30pl。其底部可以直接使用油镜，进行高分辨率成像，光学效果极佳。本文中，是使用共聚焦显微镜观测钙离子染料的荧光值。 二.实验步骤 使用0.01%(w/v)的多聚L赖氨酸 (Poly L-Lysine) 对六通道载玻片进行包被3 单通道铺入3×105DT40B细胞，37℃，10%CO2环境中孵育45分钟待细胞贴壁。 使用无细胞培养基，轻轻冲洗通道，移除未贴壁细胞(图二)。 图二：冲洗换液方法，蓝色代表新的无细胞培养基 4) 用RPMI 1640培养基加入2 uM fluo-4 AM， 0.02 %(v/v)Pluronic@ F-127，加入通道中，孵育30分钟。 5用Buffer B冲洗两次细胞，可以用加入BCR抗体 anti-IgM或 1 mM CaCl2做为刺激液 使用共聚焦显微镜观测数据。 三.实验结果 图三： 由图中曲线可以看出，在没有胞外Ca²+存在的时候，对BCR的刺激((加入BCR抗体anti-lgM)和B细胞中钙离子活动成比。而当有胞外Ca²+的时候((加入1mMCaCl2)胞外对于胞内钙离子的活动也有非常显著的影响，会随着Anti-IgM的升高，胞内钙离子浓度会降低。