螺旋霉素发酵液中有机酸检测方案(液相色谱仪)

液相色谱法测定螺旋霉素发酵液中有机酸 螺旋霉素为大环内酯类抗生素。其分子组成含有1个十六元内酯环，该内酯环的生物合成需要8个前体：5个乙酸，1个丙酸，1个丁酸和1个未知前体（二碳单位）。在螺旋霉素链霉菌中，螺旋霉素的生物合成是由初级代谢供给的活化的乙酸、 丙酸、丁酸等前体单元缩合而成。文献指出，在培养基内加入这些脂肪酸前体可提高螺旋霉素的产量。关于前体的添加时间、添加量及前体的利用度对螺旋霉素发酵的影响都有报道。因此，研究螺旋霉素生物合成中有机酸的种类和变化趋势，对了解螺旋霉素代谢网络，进而指导其工艺优化，提高发酵产量有着极其重要的意义。 在测定发酵液中有机酸的方法中，GC和HPLC是目前最精确和直接的方法。而采用HPLC测定螺旋霉素发酵液中有机酸的含量，样品制备简便，分离效果好，方法的精密度和回收率都很高，速度快，适于大批量发酵液的分析。本方法的建立对研究螺旋霉素生物合成中的有机酸种类和变化趋势，了解螺旋霉素代谢网络提供了一个可靠、快捷的分析手段。 实验部分 仪器 LC-600B智能全控液相色谱仪 (​http:​/​​/​www.kj17.com​/​html​/​kjcp​/​yexiangsepuyi_1179_440.html" \t "http:​/​​/​www.kj17.com​/​html​/​_blank​)1套（包括P600泵2台，UV600检测器1台，进口原装7725i进样阀1只， Zorbax 300-SB C18（150mm×4.6mm i.d.，5μm）色谱柱1根，100μL进样针1根，色谱工作站（反控主机）1套，混合器1只）（南京科捷分析仪器有限公司）、超声波清洗器1台（南京科捷分析仪器有限公司）、溶剂过滤器1套（南京科捷分析仪器有限公司）等。 试剂 流动相的配制：取1.15mL85%的磷酸，用超纯水稀释并定容至1000mL（用NaH2PO4调节PH至2.32），用0.45μm合成纤维素酯膜进行真空超滤，超声波脱气后备用。 标准溶液配制：精确吸取0.38mL乙酸、0.41mL丙酸、0.42mL丁酸于100mL容量瓶中，用超纯水溶解并定容（稀释成梯度进样分析绘制标准曲线）。 样品处理 取发酵液30mL，滤纸过滤去除菌体，将滤液冷冻保存备用。分析检测时取1mL滤液离心（10000r/min，10min），上清液用0.22μm的膜过滤，待测。 分析条件 色谱柱：Zorbax 300-SB C18（150mm×4.6mm i.d.，5μm） 流动相A：0.01mol/L磷酸水溶液（用NaH2PO4调节PH至2.32） 流动相B：甲醇 线性洗脱程序：70%A 100%B 流速：0.6mL/min 柱温：35℃ 检测波长：210nm 进样量：20μL 色谱图 有机酸标准液的色谱图 1 乙酸；2 丙酸；3 丁酸 螺旋霉素为大环内酯类抗生素。其分子组成含有1个十六元内酯环，该内酯环的生物合成需要8个前体：5个乙酸，1个丙酸，1个丁酸和1个未知前体（二碳单位）。在螺旋霉素链霉菌中，螺旋霉素的生物合成是由初级代谢供给的活化的乙酸、 丙酸、丁酸等前体单元缩合而成。文献指出，在培养基内加入这些脂肪酸前体可提高螺旋霉素的产量。关于前体的添加时间、添加量及前体的利用度对螺旋霉素发酵的影响都有报道。因此，研究螺旋霉素生物合成中有机酸的种类和变化趋势，对了解螺旋霉素代谢网络，进而指导其工艺优化，提高发酵产量有着极其重要的意义。在测定发酵液中有机酸的方法中，GC和HPLC是目前最精确和直接的方法。而采用HPLC测定螺旋霉素发酵液中有机酸的含量，样品制备简便，分离效果好，方法的精密度和回收率都很高，速度快，适于大批量发酵液的分析。本方法的建立对研究螺旋霉素生物合成中的有机酸种类和变化趋势，了解螺旋霉素代谢网络提供了一个可靠、快捷的分析手段。实验部分仪器LC-600B智能全控液相色谱仪1套（包括P600泵2台，UV600检测器1台，进口原装7725i进样阀1只， Zorbax 300-SB C18（150mm×4.6mm i.d.，5μm）色谱柱1根，100μL进样针1根，色谱工作站（反控主机）1套，混合器1只）（南京科捷分析仪器有限公司）、超声波清洗器1台（南京科捷分析仪器有限公司）、溶剂过滤器1套（南京科捷分析仪器有限公司）等。试剂流动相的配制：取1.15mL85%的磷酸，用超纯水稀释并定容至1000mL（用NaH2PO4调节PH至2.32），用0.45μm合成纤维素酯膜进行真空超滤，超声波脱气后备用。标准溶液配制：精确吸取0.38mL乙酸、0.41mL丙酸、0.42mL丁酸于100mL容量瓶中，用超纯水溶解并定容（稀释成梯度进样分析绘制标准曲线）。样品处理取发酵液30mL，滤纸过滤去除菌体，将滤液冷冻保存备用。分析检测时取1mL滤液离心（10000r/min，10min），上清液用0.22μm的膜过滤，待测。分析条件色谱柱：Zorbax 300-SB C18（150mm×4.6mm i.d.，5μm）流动相A：0.01mol/L磷酸水溶液（用NaH2PO4调节PH至2.32）流动相B：甲醇线性洗脱程序：70%A100%B流速：0.6mL/min柱温：35℃检测波长：210nm进样量：20μL色谱图有机酸标准液的色谱图1 乙酸；2 丙酸；3 丁酸