肉制品中氯霉素检测方案(试剂盒)

中国家禽2014年第36卷第23期China Poultry Vol.36，No.23.2014实验研究◎基础兽医◎ 禽肉中氯霉素残留化学发光酶免疫分析方法的建立* 顾华兵'，陈银辉2，樊凌翰’，雷江红，邢佑尚2，苏丽芳?，姚 琳²，吴小平2，王文珺2**，王照鹏2(1.江苏省家禽科学研究所，江苏扬州225125： 2.北京维德维康生物技术有限公司，北京 100095：3.陕西省动物卫生监督所，陕西西安710016) 摘要：研究旨在建立检测禽肉中氯霉素残留的化学发光酶免疫分析方法 (CLEIA)；通过方阵法确定包被抗体及酶标抗原的浓度，建立了氯霉素直接竞争性 CLEIA 的标准曲线，用CLEIA与液相色谱串联方法 (LC-MS/MS) 检测禽肉中氯霉素的含量。结果表明，建立的检测鸡肉和鸭肉中氯霉素残留的CLEIA法，检测限分别为 13.4 pg/g和12.8 pg/g，CLEIA法的回收率为74.7%~107.8%，变异系数为4.5%~11.5%，CLEIA 和LC-MS/MS 两种方法分析结果无显著性差异(P>0.05)。 关键词：氯霉素；化学发光酶免疫分析；禽肉 UDevelopment of Chemiluminescent Enzyme|Immunoassay for thenDetermination of Chloramphenicol Residues in Poultry Meat GU Huabing，CHEN Yinhui，FAN Linghan，LEI Jianghong，XING Youshang， SU Lifang'，YAO Lin’，WU Xiaoping'，WANG Wenjun**，WANG Zhaopeng (1.Jiangsu Institute of Poultry Science，Yangzhou，Jiangsu2.Beijing WDWK Biotechnology Co.，Ltd.，Beijing 100095： 225125： 3.Shaanxi Animal Health Supervision，Xi'an，Shaanxi 710016) Abstract： The aim of this paper was to develop a chemiluminescent enzyme immunoassay CLEIA) for the determinationof chloramphenicol (CAP) residues in poultry meat. The concentrations of coated antibody and HRP labelled antigen ofCLEIA for CAP were determined with chessboard format and the standard curves of CAP were established. Poultrysamples were spiked with CAP and the concentrations were detected with both CLEIA and LC-MS/MS methods. Theresults showed that the detection limit of CLEIA for chicken and duck meat were 13.4 pg/g and 12.8 pg/g，respectively.The recoveries of CLEIA for poultry were 74.7% to 107.8%，and coefficients of variability were 4.5% to 11.5%. There ( 收稿日期：2014-07-08 ) ( 修回日期：2014-09-16 ) ( *基金项目：国家科技支撑计划项目(2012BAK08B06)；科技型中小企业技术创新资金项目(Z13010101440) ) ( **通讯作者，E-mail：w w j107@163.com ) were no distinct difference between the results of CLEIA and LC-MS/MS (P>0.05) ， which showed that CLEIA couldbe used for the detection of CAP in poultry meat. Key words：chloramphenicol (CAP) ；chemiluminescent enzyme immunoassay (CLEIA) ；poultry meat 氯霉素 (CAP，结构式见图1)属抑菌性广谱抗生素，其通过阻止细胞内氨基酞 tRNA 与核糖体50S亚基A位点的结合，阻碍蛋白质的合成。氯霉素曾被广泛应用于畜牧业生产中，对畜禽的疾病控制和治疗起到重要作用。但后来研究发现，氯霉素对人的造血及消化系统有严重的毒性反应，可引发再生障碍性贫血；同时还会引起视神经炎和皮疹等不良反应"。目前，许多国家和地区严禁在食用性动物中使用氯霉素，欧盟、美国等均在法规中规定氯霉素残留限量标准为“零容许量”。我国农业部“235号”公告中规定氯霉素及其盐、酯禁止用于任何食品动物，所有可食性动物组织中不得检出。然而氯霉素的抑菌效果好、价格低廉，非法使用现象十分突出，我国出口禽肉因时常检出氯霉素残留遭退回，经济损失惨重，严重影响对外贸易，所以有必要建立高效、灵敏的氯霉素残留检测方法。 目前，相继建立了检测氯霉素残留的仪器分析和酶联免疫分析方法-51。在前期研究的基础上，本试验建立了更为简单、灵敏和快速的化学发光免疫检测方法，有助于实现对禽肉中氯霉素残留的筛查。 图1 氯霉素结构式 1 材料与方法 1.1 试剂与材料 氯霉素标准品、明胶、ProClin 300购自 Sigma公司；氯霉素抗体、氯霉素酶标抗原为北京维德维康生物技术有限公司自制；化学发光酶标板购自丹麦Nunc 公司；乙酸乙酯、正己烷等试剂均购自 北京国药集团。 CLEIA 所用的缓冲溶液： ①包被缓冲液：碳酸盐缓冲液 0.05 mol/L，pH9.6；②0.02 mol/L 磷酸盐缓冲液 (PBS) ：PB缓冲液中加入0.15 mol/L NaCl，pH 7.2；③洗涤液：1000mL PBS加1mL Tween-20；④酶稀缓冲液：1000mL PBS加1mL Tween-20、1g明胶和300pLProClin 300；⑤封闭液：1000mL PBS加入5g明胶和300 uL ProClin 300。 1.2主要仪器 半自动化学发光仪(厦门天众达科技有限公司)；离心机(TDL-40C型，上海安亭科学仪器厂)；涡动仪 (HQ-60型，北京方正生物科技发展有限公司)；超纯水仪(Milli-Q型，美国Milli-Q公司)；氮吹仪(N-EVAP型，美国Organomation公司)。 1.3建立氯霉素的标准曲线 用方阵法筛选抗原抗体的工作浓度，并建立直接竞争性CLEIA的标准曲线： ①包被抗体用包被缓冲液稀释，加入酶标板中(100 pL/孔)，4℃过夜，弃包被液，洗涤液洗涤一次。 ②加入封闭液(150 uL/孔)在37℃下封闭1h，弃封闭液。 ③将50 uL不同浓度的标准品(0、20、60、180、540、1620 pg/mL)或样品溶液分别加到各孔中，每个浓度重复2次。再在每孔中加入50 pL氯霉素酶标抗原工作液，轻轻振荡酶标板10s，充分混匀，室温下(25±2)℃，避光反应20 min，洗涤四次。 ④在每孔中加入新配制的化学发光底物液A、B的混合液(按照1：1比例混合)50 uL，避光孵育5 min后，在化学发光仪上读出光子数。 ⑤以CAP标准品浓度的对数为横坐标，不同浓度的CAP标准品的抑制率为纵坐标，用软件Origin 8.0绘制标准曲线，建立四参数回归方程。回归方程如下： 其中Y为抑制率；A和D分别代表药物浓度 无穷大和无穷小时分别对应的结合率；B为曲线变形点的斜率；C为ICso对应的药物浓度。 1.4 样品测定 准确称取(3±0.03) g均质处理后的鸡肉或鸭肉样品于50 mL离心管中。加入6mL乙酸乙酯，充分涡动1 min 后，4000g以上离心10 min；吸取上层乙酸乙酯4 mL于新的离心管中；在50~60℃水浴条件下，用氮气吹干乙酸乙酯；离心管中加入2mL正己烷，充分涡动10s，再加入1mL样品稀释液，充分涡动30s，使样本中的脂肪充分溶解到正己烷中；4000g以上离心5 min，去去上层正己烷及中间层杂质；取50 uL溶液进行检测。该前处理方法稀释系数为0.5。 2 结果与分析 2.11反应体系的确定 通过方阵法选择最佳抗原、抗体的浓度：纯化后的腹水20万倍稀释包被酶标板，酶标抗原4万倍稀释。加样方式为50uL标准品(或样品)+50pL酶标抗体；根据抑制率、零标光子数RLU(一般要求>800000)及空白样本的光子数与零标准品光子数的偏差，确定酶促反应条件：温度为25℃ 20 min (见表1)。 UU .UU 表1反应温度的确定试验结果 反应温度 零标 0.02ng/mL 抑制率 空白鸡肉 RLU 标准品RLU (%) RLU 25℃ 825653 684219 82.9 809808 37℃ 998823 906454 90.8 811256 分别添加不同体积的化学发光底物液，根据零标光子数、抑制率，化学发光底物液的添加体积 确定为A液+B液=25 uL+25 uL完全可满足检测要求(见表2)。 表2 化学发光底物液加样体积的确定 底物液体积(uL) 零标RLU 0.02 ng/mL标准品RLU 结合率(%) 25+25 837063 688050 82.1 50+50 839664 683640 81.4 75+75 840825 696812 82.0 2.2 标准曲线的建立 建立直接竞争性CLEIA的标准曲线(见图2)，IC50=58.2 pg/mL，相关系数 r=0.9983，线性范围为：20~1620 pg/g。抗体与氯霉素类似物琥珀氯霉素交叉反应为121%，与氯霉素碱的交叉反应<5.0%，与氟苯尼考、链霉素、红霉素、大观霉素、新霉素的交叉反应<0.1%，说明该抗体对氯霉素的特异性较好。 JH .氯霉素浓度 (pg/mL)m 图2氯霉素化学发光免疫分析标准曲线 2.3 检测限的确定 检测空白鸡肉和鸭肉各20分，根据样本检测限(LOD)=20份空白样本(平均值±标准差)+3倍标准偏差(SD) ，由表3确定鸡、鸭肉中氯霉素的检测限分别为13.4 pg/g和12.8 pg/g。 表3鸡、鸭肉检测限的确定 样本 空白样本测值(pg/g) 平均值 标准差 LOD (pg/g) 鸡肉 3.4 2.1 0.5 1.4 5.6 3.2 4.9 10.2 5.7 3.6 4.7 2.9 13.4 1.7 5.2 11.2 6.7 2.8 7.1 7.9 4.4 1.7 4.1 鸭肉 4.1 5.3 6.8 11.2 5.7 6.1 7.0 3.9 5.1 5.8 5.2 2.5 12.8 2.5 1.6 5.8 0.6 10.6 3.6 5.2 4.9 3.7 4.6 2.4 样品添加回收试验 样本添加回收试验结果见表4。在鸡肉和鸭肉样品中添加CAP，直接竞争性 CLEIA 法的回收率为74.7%~107.8%，变异系数为4.5%~11.5%。采用国家标准准所述LC-MS/MS法检测样本的回 收率为 81.3%~95.9%，变异系数为5.0%~9.8%。经单因素方差分析，两种方法的分析结果无显著性差异(P>0.05)，本研究所建立的 CLEIA 方法可用于禽肉样品中氯霉素的检测。 表4 直接竞争性CLEIA与LC-MS/MS测定结果的比较 样本 添加值 (pg/g) 测量值(n=3) (pg/g) 回收率(%) 变异系数 CV(%) P值 CLEIA LC-MS/MS CLEIA LC-MS/MS CLEIA LC-MS/MS 鸡肉 15.0 13.1±1.5 12.2±1.2 86.7 81.3 11.5 9.8 >0.05 50.0 41.2±3.6 43.4±4.1 82.4 86.8 8.7 9.4 >0.05 鸭肉 150.0 161.7±7.3 142.5±8.7 107.8 95.0 4.5 6.1 >0.05 15.0 11.2±0.9 12.7±1.2 74.7 84.7 8.0 9.4 >0.05 50.0 39.5±2.7 42.6±3.6 79.0 85.2 6.8 8.5 >0.05 150.0 143.9±8.2 147.2±7.4 95.9 98.1 5.7 5.0 >0.05 讨论 3.1 酶标抗原免疫体系的建立 目前，氯霉素免疫分析的方法主要有间接法或者酶标抗体的直接法7，8，本研究工作使用辣根过氧化物酶直接标记抗原，不需要使用酶标二抗，一步获得检测结果，简化了检测步骤。酶标抗原一般来说稳定性较差，长时间保存容易不稳定，效价下降。本研究使用维德维康专门研制的酶标记物稀释液，可稳定保存酶标抗原，试剂盒可稳定保存半年以上。欧盟委员会决议(2003/181/EC)规定氯霉素检测的最低要求执行限量为300 pg/g，本研究建立的鸡肉、鸭肉的检测限都远低于这个值，完全满足检测要求。 3.2 方法的适用性 有研究证明，氯霉素在禽肉中基本上以原形存在0，所以选择合适的有机溶剂可以将其从样本中提取出来。本研究建立的 CLEIA 方法可准确、稳定地检测禽肉中的氯霉素含量，与北京维德维康生物技术有限公司研发的氯霉素酶联免疫检测试剂盒比较，孵育反应时间缩短为20 min，而且不需要终止的步骤，使得反应时间缩短近一半，符合大量样本筛查的快速要求。 迄今为止，动物组织及动物源性食品、蜂王浆、蜂蜜中氯霉素的ELISA 检测方法已经成为国家或地方标准1~15。CLEIA法在兽药残留检测中的应用刚刚起步，还需一定时间的应用和推广，才能实现在食品安全检测领域的广泛应用。 ( 参考文献： ) ( 1 Leonidas P P ， An t ony C C . 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All rights reserved. http：//www.cnki.net 研究旨在建立检测禽肉中氯霉素残留的化学发光酶免疫分析方法 （CLEIA）；通过方阵法确定包被抗体及酶标抗原的浓度，建立了氯霉素直接竞争性CLEIA的标准曲线，用CLEIA与液相色谱串联方法 （LC-MS/MS）检测禽肉中氯霉素的含量。结果表明，建立的检测鸡肉和鸭肉中氯霉素残留的CLEIA法，检测限分别为13.4 pg/g和12.8 pg/g，CLEIA法的回收率为74.7%~107.8%，变异系数为4.5%~11.5%，CLEIA和LC-MS/MS两种方法分析结果无显著性差异 （P>0.05）。