大鼠腿部肌肉组织中生物标记物检测方案(气质联用仪)

2样品衍生化 基于COrbitrap GC-MS 的非靶向代谢组学 Stefan Weidt， Bogusia Pesko，Cristian Cojocariu， Paul Silcock， Richard J. Burchmore，’ and Karl Burgess?1Thermo Fisher Scientific， Runcorn， UK 2Glasgow Polyomics， University of Glasgow， Glasgow， UK 法医学；代谢组学；多变量统计分析； QExactive GC 系统 引言 代谢组学旨在表征和定量生物系统中的完整小分子代谢通路或代谢物组。代谢物组包含小分子多元混合物(包括氨基酸、糖和磷酸糖、生物胺和脂质)。非靶向代谢组学极具挑战性，因为其要求定性和定量上百个不同种类化合物，而有关这些代谢物的经验知识有限。因此，有必要使用一个既可以以非靶向的方式灵敏检测特定分子，又可以提供精确质量数信息，用于确认未知物并对其进行结构解析的检测系统。 气相色谱质谱联用仪(GC-MS)基于其自身的优点经常用于代谢组学分析，尤其是其色谱分辨率、重现性、峰容量和便于使用的质谱库。GC为非靶向代谢组学中生物标志物的发现提供了卓越的色谱分离能力，但是，由于目前缺乏高端质谱仪的支持，从而限制了提供用于分析复杂样品(例如，哺乳动物的肌肉组织)的动态范围、精确质量数和扫描速度。鉴于大部分重要代谢物的极性特征，必须将其衍生化，以使其有效挥发，从而确保得到良好的色谱分离。代谢组学分析尤其是临床代谢组学要求高通量和先进的自动化技术。 本项研究展示了新型 Thermo ScientificTM OrbitrapTM GC-MS完整非靶向代谢组学工作流程，检测了大鼠模型中的生物标记物，以判定其死亡时间。死亡时间(PMI)推断是法医调查中一项最关键也是最困难的任务，尤其当尸体温度与周围环境温度达到平衡后。由于当前用于确定 PMI的方法不精确性且以目视检查尸体为主。因此，建立一种实验方法，使用耐用生物标志物推断死亡时间可辅助法医调查。 该 GC-MS 装置使用基于 Orbitrap 的检测器，得到超高质量 数分辨率、亚 ppm 质量数精度、宽动态范围以及一定的扫描速度，用于有效定量极复杂代谢组学样品。高分辨率、稳定的质量数精度和快速的扫描速度是进行稳定的数据解卷积的关键因素，以检测重叠TIC 峰中的化合物，进行非靶向代谢组学分析。电子轰击电离(El)裂解模式也适合基于应用广泛的NIST 库和 Wiley 库进行匹配，以识别化合物，同时为更深入的表征提供精确质量数。 样品制备 从各个大鼠腿部肌肉组织切片取样，以时间顺序增加进行尸检及采样。采用氯仿/甲醇/水(1：3：1)提取经匀质的组织切片中的代谢物，在冰块下孵育1小时。蛋白质和 DNA 进行离心沉淀。去除上清液，贮藏在-80℃条件下备用。 移取 200 pL提取液至1.5mL 硼硅玻璃小瓶中，加盖9mm螺丝盖。然后，将样品置于 Thermo ScientificTM Reacti-VapTM 蒸发器中，在30℃条件下以低流速氮气流干燥 60 min。以下所有衍生化步骤均采用 Thermo ScientificTM TriPlusTM RSH 自动样品处理器进行。 加入 20 pL 20 mg/mL(w/v)甲氧基酸盐酸盐的吡啶溶液至每个干燥小瓶中。将小瓶涡旋10秒并在30℃条件下孵育60 min。甲氧基化步骤完成以后，加入 30 pL MSTFA +1%TMCS(N-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺+1%三甲基氯硅烷)的混合液，进一步涡旋30秒。将小瓶置于45℃条件下孵育60 min 进行硅烷化。将样品冷却至室温以备进样。 GC-MS分析 所有实验均采用 Thermo ScientificTM Q ExactiveTM GC 组合型四极极 Orbitrap 质谱仪进行。采用 TriPlus RSH 自动进样器进样，采用 Thermo ScientificTM TRACETM 1310 GC 色谱仪和Thermo ScientificTM TraceGOLDTM TG-5SilMS 15 m x 0.25mm l.D. × 0.25 pm 薄膜毛细管柱(P/N：26096-1301)进行色谱分离。仪器参数的其他详细信息见表1和表2。 数据分析流程首先使用 MSConvert ( ProteoWizard 套件1的一部分)将原始数据文件转换为MzXML 文件。使用 XCMS包?和centWave 算法提取峰。已检测到的峰以 PeakML 格式输出，然后使用MzMatch.R 包对已检测到的峰进行后处理(过滤每组重复进样的最低检测值、相对标准偏差和对El碎片组进行分组的相关性匹配)。3生成的文本文件输出使用 IDEOM 软件4进行单变量统计处理，使用 SIMCATM 13.0.35 进行多变量统计处理。使用 Thermo Scientific 解卷积软件进行峰簇识别和解析。 将八只大鼠尸体置于室温下四天。每日提取肌肉组织进行分析，共检测16个样品中代谢物浓度的变化以分析尸体分解程度。对样品进行随机分析以减小系统误差。代谢组学优化后的分析流程见图1。 TRACE 1310 GC 参数 进样量(pL) 1.0 衬管 单锥形(P/N 453A1345) 入口(℃) 250 入口模块和模式 SSL， 分流1：60 载气(mL/min) He，1.2 柱温箱温度程序 温度1(℃) 70 保持时间(min) 2 温度2(℃) 325 速度(℃/min) 10 保持时间(min) 8.5 表2.质谱仪参数 Q Exactive GC 质谱仪参数 传输线(℃) 275 电离类型 EI 离子源(℃) 230 电离能量(eV) 70 采集模式 全扫描 质量数范围(m/z) 50-750 质量数分辨率(m/z200 时的 FWHM) 60，000 质量数内标的质量数(m/z) 207.03235 图 1. QExactive GC 系统代谢组学研究的工作流程。以不同颜色显示工作流程包中的任务分工：绿色用于生物技术人员；橙色用于实验室技术人员；紫色用于仪器操作人员；蓝色用于生物学信息处理人员。 分钟 图2.大鼠肌肉组织样品代谢0-3天后的 GC-MS 色谱图(自上而下天数增加)，×轴为保留时间，Y轴为强度(固定为1E9计数)。例如，记下高亮区域中峰强度随时间的变化。 BP：218.10272 @5.44E+008 化合物发现阶段 QExactive GC 系统获取了每个样品的全扫描色谱图(图2)。该系统在较宽的动态范围内采集不同浓度水平代谢物的全扫描色谱图，不会丢失任何精确质量数信息。使用自动峰选取(结合使用 XCMS 和 MzMatch.R)功能提取每个El峰簇。在该步骤中，已检测到1193个明显峰簇并进行了初步定量，强度阈值为100，000。已解卷积峰簇的示例见图3. 定量阶段 首先使用单变量统计方法分析结果。使用 Student's t 检验对比每个时间点和时间零点。将每个代谢物的平均 TO 强度设为1，倍数变化显示为1的倍数值，以方便对比强度明显不同的代谢物(图4和图5)。已检测到272个代谢物的平均强度发生显著性变化(P值小于0.05)，包含已检测峰簇的定量矩阵示例见表3。 图3.已解卷积峰簇被推断识别为酪氨酸。 TO/T3强度比 图4.发生显著性变化代谢物的火山图。每个代谢物物深蓝色菱形表示。强度比(×轴)是指 TO/T3时代谢物的倍数变化，Y轴显示代谢物的P值。因此，右上方和左上角的代谢物是倍数变化最大且最具有统计学意义的代谢物。 酪氨酸-三甲基硅脂-匹配：818，R匹配：891，概率：82.8% 图5.数据分析流程的总结。对原始数据进行峰检测和解卷积(a)，然后将其以基峰的形式显示在 IDEOM 代谢组学软件中(b)，含定量信息和定量统计方法。IDEOM 软件也提供定量图形信息(c)，该图显示了每种条件下的平均强度和标准偏差，本例中每种条件下含四份相同的生物样品。使用 NIST 库归属目标峰，(d)证实了质谱数据的匹配的结果，图下方含已归属衍生化氨基酸的Nist分数值。 表3.已检测峰簇的定量矩阵。基峰(峰簇中强度最大的峰)、保留时间(RT)和检测到的最大强度见第 1-3列。将 TO的强度归一化为1，其他时间点的强度与 TO 强度相比并视情况以不同颜色显示，见第4-7列。第8-11列包含每项比值的Ｔ检验P值。 基峰质量数 RT 最大强度 TO T1 T2 T3 T检验： TO：TO T检验： T1：TO T检验： T2：TO T检验： T3：TO 219.1100 10.71 507930367 1.0 2.7 3.4 4.5 1.000 0.008 0.000 0.003 232.1184 11.78 291673570 1.0 1.5 1.6 2.1 1.000 0.043 0.055 0.030 232.1184 12.41 941914122 1.0 5.9 8.5 11.0 1.000 0.013 0.001 0.002 156.0840 15.32 1163630714 1.0 2.1 1.9 2.0 1.000 0.019 0.008 0.021 174.1128 16.18 203636192 1.0 2.5 3.2 5.0 1.000 0.015 0.001 0.026 156.1203 16.88 1169362271 1.0 3.6 3.9 5.1 1.000 0.000 0.000 0.007 使用 SIMCA 软件进行多变量统计分析。5将结论数据转化为更为直观的对数值，将Y类别设为各时间点，生成数据的偏最小二乘判别分析(PLS-DA)模型。该软件生成分数图和载荷图，以显示沿着主成分每个时间点的聚类和分离(图6)情况。从本次分析可知，死亡后立即取样的样品(RAT_TO)聚集在一起，与已分解的大鼠样品(T1-T3)具有显著性差异。从 T1-T3样品中可以观察到分组聚类和持续分解。X或Y轴上的位移表示某一代谢物对分数图中样品群组之间分离的作用大小。在本例中，X轴将 TO与T1-3分开，Y轴将T1、T2 和T3分开(图6)。载荷图上的每个蓝点表示每个已检测到的含El碎片离子簇的代谢物(图7)。 图6.分解数据的 PLS-DA模型。该模型为有监督多变量分析，将高维数据(例如，大量强度不同的代谢物)折叠为涵盖数据集中主要变化的几种主成分。在本例中，×轴是主成分1，Y轴是主成分2。注意，本项研究对样品进行了适当聚类，每个群组聚集在一起， TO已明显与其他群组分开。 R2x[1]=0.385 R2x[2]=0.127 SIMCA 13.0-31/03/201511：47：15(UTC-1) 图7.PLS-DA 模型的载荷图。根据代谢物(用蓝色原点表示)对群组分离的作用大小对代谢物进行聚类分析，见图6。例如，最右边的代谢物对于定义 TO样品作用很大。 推测化合物 ID RT (min ) NIST正向匹配 与 TO 相比的增加倍数 基峰碎片 元素组成 ppm 精度 (基峰) ppm 精度(分子离子) L苏氨酸，3TMS 10.71 795 2.8 C.H，ONSi， 0.27 0.13 L天冬氨酸， 3TMS 11.78 707 7.0 C.H，NO，Si， 0.18 0.34 L甲硫氨酸， 2TMS 12.40 749 15.0 C，H，NSSi 0.24 0.04 L谷氨酰胺-3TMS 15.32 815 2.0 C，H， NOSi 0.53 0.21 腐胺， 4TMS 16.18 870 2.0 CHNSi， 0.05 N/A 赖氨酸， 4TMS 16.88 732 5.1 CHNSi 0.19 0.05 识别阶段 依据现有商用库(NIST ) 识别发生显著性变化的代谢物，首先将其与氨基酸、与分解相关的化合物进行匹配(表4)。基于多变量统计分析的整个流程总结见图5，图中对峰进行了解卷积、定量和识别。所有选择的化合物得到的分数均较高(>700)，使用精确质量数进行碎片匹配，从而进一步提高了库匹配结果的准确度(表3)。 ( 结 论 ) ( 在此介绍的Q Exactive GC系统的工作流程顺序为样品制备、 自 动衍生化、GC分离和质谱检测、数据分析和结果报告。这一工作流程使QExactive GC 系统成为挥发性化合物和需衍生化非挥 发性化合物进行代谢组学分析的独特分析工具。 ) ( 卓越的色谱分离能力、可重现的色谱分离结合快速数据采集使Q Exactive GC 系统成为复杂代谢组学分析的理想平台。 ) ( 超高分辨率、始终如一的亚 ppm 的精确质量数测量为复杂生物 分解基质中存在的多种代谢物提供了可靠和高选择性的分析。 ) ( 较宽的动态范围为分析样品中的代谢物提供高灵敏度和持续检测，且质量数精度丝毫不受影响，同时为已检测到的代谢物提供精确的相对定量。 ) 可依据已有商用库使用获得的El数据对化合物进行初步识别，使研究人员对结果进行评价。同时，得到的精确质量数允许对数据进一步分析，如使用裂解分析(例如，Mass Frontier)或使 赛默飞世尔科技(中国)有限公司 全国服务热线：8800 810 5118 用标准品进一步确认目标化合物。本例中，氨基酸信号的时间依赖性演变为检测死亡时间提供了一种简便的生化法医分析检测法。 ( 致 谢 ) 感谢Mark McLaughlin 博士为我们提供了研究用大鼠。 ( 参考文 献 ) ( 1. 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SIMCA Page， U metrics Website. h t tp ： / /www.um etr i c s . c om / pr o duc ts/simca ) ( (accessed Apr. 22， 2015). ) SCIENTIFIC 支持手机用户)Part of Thermo Fisher ScientificAN C_GCMSMS_ 本项研究展示了新型 Thermo Scientific™ Orbitrap™ GC-MS 完整非靶向代谢组学工作流程，检测了大鼠模型中的生物标记物，以判定其死亡时间。死亡时间（PMI）推断是法医调查中一项最关键也是最困难的任务，尤其当尸体温度与周围环境温度达到平衡后。由于当前用于确定 PMI 的方法不精确性且以目视检查尸体为主。因此，建立一种实验方法，使用耐用生物标志物推断死亡时间可辅助法医调查。该 GC-MS 装置使用基于 Orbitrap 的检测器，得到超高质量数分辨率、亚 ppm 质量数精度、宽动态范围以及一定的扫描速度，用于有效定量极复杂代谢组学样品。高分辨率、稳定的质量数精度和快速的扫描速度是进行稳定的数据解卷积的关键因素，以检测重叠 TIC 峰中的化合物，进行非靶向代谢组学分析。电子轰击电离（EI）裂解模式也适合基于应用广泛的 NIST 库和 Wiley 库进行匹配，以识别化合物，同时为更深入的表征提供精确质量数。