Molecular Devices杂交瘤高通量筛选解决方案

杂交瘤高通量筛选解决方案——让抗体药物筛选赢在起点 www.MolecularDevices.cominfo.China@moldev.com 简介： 众所周知，单克隆抗体在科研、疾病诊断以及治疗等方面具有非常重要的作用。单克隆抗体药物具有靶向性明确、低毒性和不良反应少等优点，在肿瘤的生物治疗及靶向治疗中发挥重要作用。目前，抗体药物市场前景广阔，已成为制药行业中发展最快、活力最强和技术含量最高的领域。为了获得具有特异性的抗体，首先需要筛选能够表达分泌特异性抗体的杂交瘤细胞系。实验室常规的方法就是通过小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞的融合，获得杂交瘤细胞。通过在培养基里加入筛选压力，只有脾细胞和瘤细胞成功融合的杂交瘤能够存活。筛选杂交瘤的主要挑战在于如何快速、高效地从成千上万的杂交瘤细胞里面找到生长良好、能够分泌特异性抗体的克隆，并且尽可能确保为单克隆。 Molecular Devices为杂交瘤的筛选提供了全方位的高通量解决方案，能够最大化提高筛选特异性杂交瘤的效率，并且节省筛选时间。ClonePix2是一个哺乳动物细胞筛选系统，通过在培养基中加入荧光标记检测试剂，能够通过荧光筛选并自动化挑取表达分泌特异性抗体的杂交瘤克隆。CloneSelect Imager是一个无标记活细胞成像系统，能够客观、快速检测细胞在孔板里的生长情况，并提供克隆单细胞来源证明，确保筛选稳定的单克隆用于下游进一步研究。此外，为了优化细胞的生长， MolecularDevices提供了CloneMedia和CloneMatrix两种型号半固体培养基用于支持杂交瘤细胞生长形成独立单个的克隆。 Figure 1使用 ClonePix2系统筛选杂交瘤流程：使用杂交瘤专用的半固体培养基和检测试剂，结合ClonePix和CloneSelect Imager系统，能够更快筛选到高价值杂交瘤克隆。 杂交瘤专用CloneMedia半固体培养基 传统的杂交瘤细胞筛选方法通常为有限稀稀或者FACS，这两种方法的效率比较低，通常需要额外的几次亚克隆用于提高单克隆的概率。杂交瘤专用CloneMedia半固体培养基是一种粘稠的半固体状态培养基，能够固定单个杂交瘤细胞的位置，支持细胞生长形成单个独立的克隆，筛选之后无需额外的亚克隆步骤。CloneMedia半固体培养基含有能够近促进新融合和稳定杂交瘤细胞生长的添加剂成份，经过成份优化，支持细胞快速生长，形成规则的克隆(Figure 2)。此外，半固体培养基为透明的状态，有利于对克隆成像，鉴定单克隆以及挑取克隆(Figure2)。 Figure 2 稳定的杂交瘤克隆使用CloneSelect Imager系统成像图片：使用CloneMedia杂交瘤专用半固体培养基获得的克隆呈紧致、规则的圆形，而两个竞争对手的培养基形成的克隆则比较松散，形状不规则。此外，CloneMedia培养基背景比较干净，而另外两种培养基则有很多不规则的细胞碎片。 CloneMedia半固体培养基的粘稠度经过专门优化，适用于ClonePix2等系统进行自动化克隆挑取。如Figure 3所示，竞争对手的半固体培养基在克隆挑取之后，邻近的克隆被拉扯断裂，位置发生移动，容易引起克隆之间交叉。而CloneMedia半固体培养基，克隆挑取之后邻近克隆的位置和形状保持不变，有利于保持克隆的单克隆性和挑取正确的克隆。 Figure 3 ClonePix2系统挑取克隆前后使用CloneSelect Imager对新融合杂交瘤克隆成像图片：黄色圈标记的克隆为挑取的克隆。挑取之后， CloneMedia半固体培养基中邻近的克隆保持完整，而另一种培养基中克隆则被拉扯，形状和位置发生改变。 ClonePix2准确挑取单克隆杂交瘤细胞 杂交瘤的半固体培养以及ClonePix2挑取的准确性已经通过实验进行验证。如Figure4所示，分别将两株稳定表达IgG1和lgG2a的杂交瘤克隆混合，使用CloneMedia半固体培养基培养获得独立单个克隆 (Figure 4A)。在培养的同时，培养基中加入两种相应的荧光标记抗体： AlexaFluor488-anti-lgG1和AlexaFluor546 anti-lgG2a。使用ClonePix2系统分别在FITC和Rhodamine通道挑取表达lgG1和lgG2a的克隆到96孔板，最后通过取培养上清做ELISA验证挑到克隆的亚型。从Figure 4B可知，超过98%的克隆都为单克隆。试验数据说明两种克隆混合后，在半固体培养基培养过程中，克克能够保持独立，不会产生交叉混合； ClonePix2系统在挑取克隆的过程中可以准确挑取，挑针挑取的过程中，不会带来克隆相互交叉。 Figure 4 ClonePix2系统筛选杂交瘤克隆准确性验证：(A)分别将稳定表达IgG1和IgG2a的两株杂交瘤混合，半固体培养。使用FITC标记抗体识别IgG1克隆， 使用Rhodamine标记抗体识别IgG2a克隆。相应克隆的荧光如图A所示。(B)分别在FITC荧光通道和Rhodamine通道挑取相应的克隆，最后取培养上清进行ELISA亚型分析。 ClonePix2荧光筛选方法显著节省时间 在半固体培养基中加入荧光检测试剂Clonedetect， 比如FITC标记抗体或者抗原，通过抗原抗体亲和形成荧光复合体(Figure 5)。ClonePix2系统通过白光成像识别克隆的外形和位置，通过荧光成像对克隆的抗体亲合力进行定量 (Figure 6A)；最后根据克隆的荧光信号水平对克隆进行排序(Figure 6B)。通过荧光排序， ClonePix 2系统只挑取少量的高荧光有价值的克隆，丢掉大量的没有价值克隆，从而大大减少下游筛选工作量，显著节省杂交瘤筛选流程时间。 Figure 5 杂交瘤克隆形成荧光复合体原理示意图 A Figure 66(A)ClonePix2系统对半固体中杂交瘤克隆荧光成像图片。(B) ClonePix2系统根据杂交瘤克隆外部平均荧光值排序散点图：杂交瘤克隆在根据荧光值筛选之前，首先根据克隆形态学参数进行筛选，去掉不适合挑取的克隆。最后，剩下来的高荧光杂交瘤克隆表示克隆可以表达分泌大量的抗体蛋白，并且具有抗原特异性。ClonePix2可以自动化挑取被筛选的高荧光杂交瘤克隆，如图所示外部平均荧光值最强的前20个克隆被挑取(绿色标记)。 应用实例 ClonePix2系统用于兔杂交瘤克隆的筛选。试验流程总结如下： 融合获得杂交瘤细胞，液体培养基培养，使细胞状态恢复并保持最好活力 ·准备CloneMedia半固体培养基，加入FITC标记抗兔IgG抗体，将杂交瘤细胞悬液加入半固体培养基，分装铺到6孔板 ·10-14天培养，细胞生长成独立单个杂交瘤克隆 。使用ClonePix2系统对孔板成像，软件对克隆荧光信号水平进行定量，筛选出平均荧光最强的克隆，并挑取到96孔板 最后从2块6孔板的杂交瘤克隆里面挑取191个荧光强的克隆到96孔板，培养后取上清，通过ELISA鉴定，共获得59个阳性克隆。相比有限稀释筛选的流程， ClonePix 2技术获得的阳性克隆数目提高了2倍。 总结 Molecular Devices提供了一个快速、简单、准确的杂交瘤筛选解决方案。通过将CloneMedia杂交瘤专用半固体培养基、荧光检测试剂Clonedetect、CloneSelect Imager以及ClonePix2系统联合使用，可以更加高效地筛选到特异性单克隆抗体，缩短抗体药物研发周期，提高抗体药物开发成功率，有利于抗体药物更早上市。 公司简介 Molecular Devices始创于上世纪80年代美国硅谷，作为全球高通量仪器设备的领导者，，一直致力于为生命科学研究及药物研发提供最先进的全方位解决方案。其产品覆盖微孔板检测分析、高通量筛选、高内涵成像、高效克隆筛选等。公司以持续创新、快速高效、一流质量的产品及完善的售后服务著称业内。 Molecular Devices为您提供高性能的分析检测系统，加快和改进药物研发及基础生命科学的研究。我们的产品几乎可以满足所有通量、内涵以及预算的需求。除了科研单位和部门外，我们还帮助制药和生物技术企业从分子、细胞和系统水平去了解各项生物功能，研究开发新的治疗方法。 Molecular Devices于近几年收购了Universal Imaging Corporation(2002年)、Axon Instruments(2004年)、Blueshift Technologies(2008年)和Genetix(2011年)，从而进一步拓展了公司的产品领域。现在， Molecular Devices与Leica、Sciex、Beckman Coulter等公司均隶属于Danaher集团公司，我们的产品线包括：微孔板读板机系列、液体处理系统、电生理检测系统、神经细胞生物学仪器和软件、高内涵细胞成像系统、生物芯片扫描仪和软件、克隆挑选系统、Threshold系统以及筛选试剂等。其中，微孔板读板机系列涵盖了光吸收、荧光强度、化学发光、荧光偏振、时间偏振荧光等测读模式以及终点检测、光谱扫描、快速和慢速动力学的检测方法。 Molecular Devices总部位于美国硅谷中心桑尼韦尔市，并在全球设有多个代表处和子公司，包括美国、法国、英国、德国、中国、韩国、日本、巴西等。2005年， Molecular Devices 在上海设立了第一个中国代表处，2012年Molecular Devices在国内正式成立商务公司：美谷分子仪器(上海)有限公司。 扫一扫关注我们的官方微信 Molecular Devices 大中华区 Email： info.china@moldev.com www.MolecularDevices.com www.MolecularDevices.com.cn ( 上海 电话：8 6 -21-33721088 北京 电话：86-10-64108669 成都 电话：86-28-65588820 台北 电话：886-2-26567585 香港巷 电话：852-2248-6000 ) ( 传真：86-21-3372 1066 ) ( 传真：8 6 -10-6410 8601 传真：8 6 -28-65588831传真：8 8 6-2-2894 8267 传真：852-30102828 ) MOLECULARIDEVICES MOLECULARDEVICES