牛奶中微生物检测方案

链霉素在牛奶中残留的微生物学检测方法 蔡金华，刘雅妮，顾欣 （上海市兽药饲料监察所，上海 201103） [摘要] 目的 建立链霉素在牛奶中残留的微生物学检测方法。方法 采用微生物测定法定量检测牛奶中链霉素残留量，样品前处理用10%（m/v）三氯乙酸作为提取液，采用冷冻离心，使牛奶中残留链霉素得到提取和分离。结果 链霉素在0.10~3.20u/mL的浓度范围内具有良好线性关系（r=0.9981）,牛奶中3种添加浓度0.20、0.80、1.60 u/g的平均回收率为 97.6%（n=9）， 3种添加浓度0.20、0.80、1.60u/g 各自的RSD为：1.6 %，3.7 %，1.2 %（n=3）。结论 本方法可用于牛奶中链霉素残留的检测。 [关键词] 链霉素；牛奶；微生物学检测；三氯乙酸；冷冻离心 链霉素属于氨基糖苷类抗生素，用于革兰氏阴性菌和结核杆菌感染，在治疗家畜感染性疾病中发挥了重要作用，但抗生素的耐药性日益增强，并且毒副作用比较大[1]。为了加强兽药残留管理工作，保证畜产品质量安全，农业部于1999年发布了《动物性食品中兽药最高残留限量》的通知，并规定牛奶中链霉素的最高残留限量（MRL）为200 ug/kg。然而，相应的链霉素检测技术并不完备，由于氨基糖苷抗生素缺少发色基团，应用到HPLC时常要对其衍生化，设备条件过高，难以普及；并且其理化测定方法相当复杂和通用性差[2]。本文采用被测样品经10%（m/v）三氯乙酸提取液震荡、浸泡，冷冻离心，沉淀，将样品中的链霉素提取于上清液中，再以枯草芽孢杆菌为检定菌，用微生物检定一剂量法测定链霉素的残留量。 1 材料和设备 1.1 试药 链霉素标准品（中国药品生物制品鉴定所 批号：0308-200012 含量：731u/mg），其余均为分析纯。 1.2 试剂 10%（m/v）三氯乙酸，25%（m/v）NaOH ，0.2mol/L NaOH，0.1mol/L磷酸，磷酸盐缓冲液（PH7.8）， 链霉素标准品贮备液（精密称取适量标准品，用磷酸盐缓冲液（PH7.8）溶解，配成1000u/mL浓度的溶液）。 1.3 培养基 营养琼脂培养基（PH7.2）（《中国兽药典》二000年版 附录68页），抗生素检定培养基II（PH8.0）（《中国兽药典》二000年版 附录68页）。 1.4 试验菌种 枯草芽孢杆菌（BaciLLus SubtiLis,CMCC 63501）。 1.5 牛津杯 不锈钢管（外径（7.8±0.1）mm，内径（6.0±0.1）mm，高（10±0.1）mm）。 1.6 设备 高速冷冻离心机(Sigma公司)，高压蒸汽灭菌锅（日本TOMY），生化培养箱(SANYO公司)，抑菌圈测定仪ZY-300IV（北京先驱威锋技术开发公司）。 2 方法 2.1 菌悬液的制备 取工作用菌斜面，用适量无菌生理盐水洗下菌苔，接种于盛有200mL营养琼脂培养基的克氏瓶中，（36±1）°C培养72h，当有80%芽孢形成时停止培养，用40mL无菌生理盐水洗下菌苔制成菌悬液，装入无菌试管中，于65°C水浴中加热30min,此菌悬液置4°C冰箱中保存备用，可使用30 d。 2.2 双蝶制备 取平底双蝶，注入15mL抗生素检定培养基II（PH8.0）,待其凝固，作为底层，另取抗生素检定培养基II（PH8.0）适量加热融化，放冷至60°C，加入菌悬液适量，摇匀，在每一个双蝶中分别加入5mL，在底层上均匀摊布，作为菌层。 2.3 菌种菌悬液用量测定和最低检测限确定 将不同量的同一菌悬液分别加到抗生素检定培养基II中，作为菌层，制备检定用双碟，在双碟上放置钢管，并注入250uL 0.10 u/mL工作标准液，于（36±1）°C恒温培养（16±1）h，以产生10.00mm以上清晰完整的抑菌圈者为最适菌悬液用量，并以0.10u/mL链霉素浓度为最低检测限，可以满足牛奶中链霉素残留分析。 2.4标准曲线回归方程制备 用磷酸盐缓冲液（PH7.8）作为稀释液，采用抗生素一剂量标准曲线法，即取链霉素标准品贮备液（1000u/mL）稀释成100 u/mL，再把100 u/mL标准品溶液稀释成10u/mL，最后，10u/mL标准品溶液分别稀释成所需的各个工作标准浓度点（0.10，0.20，0.40，0.80，1.60，3.20 u/mL），中心浓度标准液设为0.80u/mL。每个工作标准浓度点制备3个碟子，在每个碟子中，间隔的3个钢管分别滴入250uL中心浓度标准液，另间隔的3个钢管分别滴入250uL工作标准浓度液，于（36±1）°C恒温培养（16±1）h。用抑菌圈测定仪测量抑菌直径，由电脑软件得到回归方程式和标准曲线图。 2.5 样品提取分离和浓度测定 把保存在4°C或温度更低的牛奶样品放到室温恒温，称取8.0 g牛奶于30mL聚丙烯离心管中，加入1.4mL 10%(m/v)三氯乙酸，充分震荡20min，而后样品冷冻离心（0°C，5000rmp,10min），取上清液，并用0.2mol/L NaOH和0.1 mol/L磷酸将其调整为PH7.8（可以先加0.05-0.10mL 25%(m/v )NaOH），再进行样品冷冻离心（0°C，5000rmp,10min），取上清液，用磷酸盐缓冲液（PH7.8）定容至10mL，得到样品提取液。而后采用抗生素一剂量求效价法，即每个样品制备3个碟子，在每个碟子中，间隔的3个钢管分别滴入250uL中心浓度标准液，另间隔的3个钢管分别滴入250uL样品提取液，于（36±1）°C恒温培养（16±1）h。用抑菌圈测定仪测量样品抑菌直径，由电脑软件得到其实际浓度。 2.6 添加阳性牛奶回收率实验 取空白牛奶样品液（预先用微生物学检测，无抗菌物质残留的牛奶），置室温平衡，称取空白牛奶100.0g，分别加入浓度为1000 u/mL 标准液0.16 mL 和100 u/mL标准液0.80mL、0.20mL，得到添加终浓度为1.60、0.80、0.20 u/g的添加阳性牛奶，而后按2.5方法进行处理。回收率计算公式：回收率=（添加阳性测得值×10）/（8.0×添加终浓度）。 2.7 重复性试验 取空白阳性牛奶（添加终浓度为0.20，0.80，1.60u/g）各3份，按2.5项下方法操作，比较各级浓度间和总浓度间的相对误差。 3 实验结果 3.1标准曲线回归方程和线性关系 标准曲线回归方程为：Y=0.7526+0.1327（X-17.8369），相关系数r=0.9981。结果表明：链霉素在0.10-3.20 u/mL的浓度范围内，抑菌圈直径与效价浓度的对数呈良好的线性关系。线性图（见图1，注：图1以抑菌圈直径为横坐标，以链霉素溶液浓度的对数为纵坐标）如下： 图1 链霉素标准曲线 3.2 回收率和重复性实验结果 链霉素在牛奶中回收率达到要求（80%~110%） ，检出重复性良好 见表1 表1 链霉素在牛奶中回收率和重复性实验 编号 添加终浓度（u/g） 测得值（u/mL） 回收率（%） RSD（%） 平均回收率（%）RSD（%） 1 0.20 0.15 93.8 2 0.20 0.16 96.9 1.6 3 0.20 0.15 95.4 4 0.80 0.59 91.8 5 0.80 0.63 98.8 3.7 97.6 6.3 6 0.80 0.61 95.0 7 1.60 1.29 100.7 8 1.60 1.33 104.1 1.2 9 1.60 1.30 101.6 4讨论和小结 4.1 本方法样品牛奶前处理实用、快速、有效。10%（m/v）三氯乙酸不仅能使牛奶中的蛋白质等变性，而且能稳定提取和保护牛奶中的链霉素。冷冻离心能快速、有效地析出、沉淀样品液中的蛋白质、脂肪等固形体。 4.2 本方法通过调节菌悬液和培养基的使用量，完全可以使0.10u/mL的标准链霉素产生大于10.00mm的抑菌圈，并以此把0.10u/mL标准浓度作为最低检测限[3，4，5]，所以，本方法灵敏度能够满足农业部规定的牛奶中链霉素最高残留限量为200ppb的检测要求。 4.3 本方法能反映抗生素真实的抗菌效能，操作性强、费用低廉、普及快、准确度高。虽然理化测定牛奶中链霉素残留的方法有许多，但基本上都需精密仪器，并且还要对链霉素进行各种衍生化等处理，实验条件苛刻，衍生技术不一[1，6，7]，难以规范化和普及。而采用本文的方法完全能满足牛奶中链霉素残留筛选检测，并且容易为制定其标准技术提供依据。 参 考 文 献： [1] 于船，王万钦.中国兽药知识大全[M].四川：四川科学技术出版社，1997.736-737，747. [2] 李俊锁，邱月明，王超.兽药残留分析[M].上海：上海科学技术出版社，2002.344-350. [3] 孟昭赫.食品卫生检验方法注解[M].北京：人民卫生出版社,1990.849. [4] 中华人民共和国国家进出口商品检验局.出口禽肉中杆菌肽残留量检验方法 SN 0295-93[S]. [5] 陈光哲，朱慰先，陈家斌.肉类食品链霉素残留量检测方法研究[J].江苏农业科学，2001，5：56. [6] Hassan Abbasi,Karl-Erik Hellenäs.Modified determination of dihydrostreptomycin in kidney,muscle and milk by HPLC[J].Analyst,1998,123:2725-2727. [7] Gertraud Suhren,Karin Knappstein.Detection of incuured dihydrostreptomycin residues in milk by liquid chromatography and preliminary confirmation methods[J]. Analyst,1998,123:2797-2801. Determination of streptomycin residues in milk by microbiologic inhibition tests CAI Jin-hua,LIU Ya-ni,GU Xin (Shanghai Municipal Supervisory Institute Veterinary Drugs and Feedstuffs ,Shanghai 201103 ) Abstract: A method is presented for the determination of streptomycin residues in milk by microbiologic inhibition tests.The new sample work-up procedures include 10% trichloroacetic acid denaturalization of protein,e.t.and precipitation of protein and fats by freezing centrifuging.The standard curves of streptomycin were all linear in the range of 0.10~3.20 u /mL (r=0.9981,n=6) .The RSD for repetition of the concentrations (0.20,0.80,1.60u/g ) spiked with streptomycin standard solution for milk was 1.6%, 3.7%,1.2 %(n=3), respectively and these average spiked recoveries were 97.6% (n=9).This method offered a rapid ,repeatable and accurate procedure convenient for determination of streptomycin residues in milk. Key words: streptomycin;milk; microbiologic inhibition tests ;trichloroacetic acid ; freezing centrifuging