链霉素在牛奶中残留的微生物学检测方法 蔡金华,刘雅妮,顾欣 (上海市兽药饲料监察所,上海 201103) [摘要] 目的 建立链霉素在牛奶中残留的微生物学检测方法。方法 采用微生物测定法定量检测牛奶中链霉素残留量,样品前处理用10%(m/v)三氯乙酸作为提取液,采用冷冻离心,使牛奶中残留链霉素得到提取和分离。结果 链霉素在0.10~3.20u/mL的浓度范围内具有良好线性关系(r=0.9981),牛奶中3种添加浓度0.20、0.80、1.60 u/g的平均回收率为 97.6%(n=9), 3种添加浓度0.20、0.80、1.60u/g 各自的RSD为:1.6 %,3.7 %,1.2 %(n=3)。结论 本方法可用于牛奶中链霉素残留的检测。 [关键词] 链霉素;牛奶;微生物学检测;三氯乙酸;冷冻离心 链霉素属于氨基糖苷类抗生素,用于革兰氏阴性菌和结核杆菌感染,在治疗家畜感染性疾病中发挥了重要作用,但抗生素的耐药性日益增强,并且毒副作用比较大[1]。为了加强兽药残留管理工作,保证畜产品质量安全,农业部于1999年发布了《动物性食品中兽药最高残留限量》的通知,并规定牛奶中链霉素的最高残留限量(MRL)为200 ug/kg。然而,相应的链霉素检测技术并不完备,由于氨基糖苷抗生素缺少发色基团,应用到HPLC时常要对其衍生化,设备条件过高,难以普及;并且其理化测定方法相当复杂和通用性差[2]。本文采用被测样品经10%(m/v)三氯乙酸提取液震荡、浸泡,冷冻离心,沉淀,将样品中的链霉素提取于上清液中,再以枯草芽孢杆菌为检定菌,用微生物检定一剂量法测定链霉素的残留量。 1 材料和设备 1.1 试药 链霉素标准品(中国药品生物制品鉴定所 批号:0308-200012 含量:731u/mg),其余均为分析纯。 1.2 试剂 10%(m/v)三氯乙酸,25%(m/v)NaOH ,0.2mol/L NaOH,0.1mol/L磷酸,磷酸盐缓冲液(PH7.8), 链霉素标准品贮备液(精密称取适量标准品,用磷酸盐缓冲液(PH7.8)溶解,配成1000u/mL浓度的溶液)。 1.3 培养基 营养琼脂培养基(PH7.2)(《中国兽药典》二000年版 附录68页),抗生素检定培养基II(PH8.0)(《中国兽药典》二000年版 附录68页)。 1.4 试验菌种 枯草芽孢杆菌(BaciLLus SubtiLis,CMCC 63501)。 1.5 牛津杯 不锈钢管(外径(7.8±0.1)mm,内径(6.0±0.1)mm,高(10±0.1)mm)。 1.6 设备 高速冷冻离心机(Sigma公司),高压蒸汽灭菌锅(日本TOMY),生化培养箱(SANYO公司),抑菌圈测定仪ZY-300IV(北京先驱威锋技术开发公司)。 2 方法 2.1 菌悬液的制备 取工作用菌斜面,用适量无菌生理盐水洗下菌苔,接种于盛有200mL营养琼脂培养基的克氏瓶中,(36±1)°C培养72h,当有80%芽孢形成时停止培养,用40mL无菌生理盐水洗下菌苔制成菌悬液,装入无菌试管中,于65°C水浴中加热30min,此菌悬液置4°C冰箱中保存备用,可使用30 d。 2.2 双蝶制备 取平底双蝶,注入15mL抗生素检定培养基II(PH8.0),待其凝固,作为底层,另取抗生素检定培养基II(PH8.0)适量加热融化,放冷至60°C,加入菌悬液适量,摇匀,在每一个双蝶中分别加入5mL,在底层上均匀摊布,作为菌层。 2.3 菌种菌悬液用量测定和最低检测限确定 将不同量的同一菌悬液分别加到抗生素检定培养基II中,作为菌层,制备检定用双碟,在双碟上放置钢管,并注入250uL 0.10 u/mL工作标准液,于(36±1)°C恒温培养(16±1)h,以产生10.00mm以上清晰完整的抑菌圈者为最适菌悬液用量,并以0.10u/mL链霉素浓度为最低检测限,可以满足牛奶中链霉素残留分析。 2.4标准曲线回归方程制备 用磷酸盐缓冲液(PH7.8)作为稀释液,采用抗生素一剂量标准曲线法,即取链霉素标准品贮备液(1000u/mL)稀释成100 u/mL,再把100 u/mL标准品溶液稀释成10u/mL,最后,10u/mL标准品溶液分别稀释成所需的各个工作标准浓度点(0.10,0.20,0.40,0.80,1.60,3.20 u/mL),中心浓度标准液设为0.80u/mL。每个工作标准浓度点制备3个碟子,在每个碟子中,间隔的3个钢管分别滴入250uL中心浓度标准液,另间隔的3个钢管分别滴入250uL工作标准浓度液,于(36±1)°C恒温培养(16±1)h。用抑菌圈测定仪测量抑菌直径,由电脑软件得到回归方程式和标准曲线图。 2.5 样品提取分离和浓度测定 把保存在4°C或温度更低的牛奶样品放到室温恒温,称取8.0 g牛奶于30mL聚丙烯离心管中,加入1.4mL 10%(m/v)三氯乙酸,充分震荡20min,而后样品冷冻离心(0°C,5000rmp,10min),取上清液,并用0.2mol/L NaOH和0.1 mol/L磷酸将其调整为PH7.8(可以先加0.05-0.10mL 25%(m/v )NaOH),再进行样品冷冻离心(0°C,5000rmp,10min),取上清液,用磷酸盐缓冲液(PH7.8)定容至10mL,得到样品提取液。而后采用抗生素一剂量求效价法,即每个样品制备3个碟子,在每个碟子中,间隔的3个钢管分别滴入250uL中心浓度标准液,另间隔的3个钢管分别滴入250uL样品提取液,于(36±1)°C恒温培养(16±1)h。用抑菌圈测定仪测量样品抑菌直径,由电脑软件得到其实际浓度。 2.6 添加阳性牛奶回收率实验 取空白牛奶样品液(预先用微生物学检测,无抗菌物质残留的牛奶),置室温平衡,称取空白牛奶100.0g,分别加入浓度为1000 u/mL 标准液0.16 mL 和100 u/mL标准液0.80mL、0.20mL,得到添加终浓度为1.60、0.80、0.20 u/g的添加阳性牛奶,而后按2.5方法进行处理。回收率计算公式:回收率=(添加阳性测得值×10)/(8.0×添加终浓度)。 2.7 重复性试验 取空白阳性牛奶(添加终浓度为0.20,0.80,1.60u/g)各3份,按2.5项下方法操作,比较各级浓度间和总浓度间的相对误差。 3 实验结果 3.1标准曲线回归方程和线性关系 标准曲线回归方程为:Y=0.7526+0.1327(X-17.8369),相关系数r=0.9981。结果表明:链霉素在0.10-3.20 u/mL的浓度范围内,抑菌圈直径与效价浓度的对数呈良好的线性关系。线性图(见图1,注:图1以抑菌圈直径为横坐标,以链霉素溶液浓度的对数为纵坐标)如下: 图1 链霉素标准曲线 3.2 回收率和重复性实验结果 链霉素在牛奶中回收率达到要求(80%~110%) ,检出重复性良好 见表1 表1 链霉素在牛奶中回收率和重复性实验 编号 添加终浓度(u/g) 测得值(u/mL) 回收率(%) RSD(%) 平均回收率(%)RSD(%) 1 0.20 0.15 93.8 2 0.20 0.16 96.9 1.6 3 0.20 0.15 95.4 4 0.80 0.59 91.8 5 0.80 0.63 98.8 3.7 97.6 6.3 6 0.80 0.61 95.0 7 1.60 1.29 100.7 8 1.60 1.33 104.1 1.2 9 1.60 1.30 101.6 4讨论和小结 4.1 本方法样品牛奶前处理实用、快速、有效。10%(m/v)三氯乙酸不仅能使牛奶中的蛋白质等变性,而且能稳定提取和保护牛奶中的链霉素。冷冻离心能快速、有效地析出、沉淀样品液中的蛋白质、脂肪等固形体。 4.2 本方法通过调节菌悬液和培养基的使用量,完全可以使0.10u/mL的标准链霉素产生大于10.00mm的抑菌圈,并以此把0.10u/mL标准浓度作为最低检测限[3,4,5],所以,本方法灵敏度能够满足农业部规定的牛奶中链霉素最高残留限量为200ppb的检测要求。 4.3 本方法能反映抗生素真实的抗菌效能,操作性强、费用低廉、普及快、准确度高。虽然理化测定牛奶中链霉素残留的方法有许多,但基本上都需精密仪器,并且还要对链霉素进行各种衍生化等处理,实验条件苛刻,衍生技术不一[1,6,7],难以规范化和普及。而采用本文的方法完全能满足牛奶中链霉素残留筛选检测,并且容易为制定其标准技术提供依据。 参 考 文 献: [1] 于船,王万钦.中国兽药知识大全[M].四川:四川科学技术出版社,1997.736-737,747. 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Determination of streptomycin residues in milk by microbiologic inhibition tests CAI Jin-hua,LIU Ya-ni,GU Xin (Shanghai Municipal Supervisory Institute Veterinary Drugs and Feedstuffs ,Shanghai 201103 ) Abstract: A method is presented for the determination of streptomycin residues in milk by microbiologic inhibition tests.The new sample work-up procedures include 10% trichloroacetic acid denaturalization of protein,e.t.and precipitation of protein and fats by freezing centrifuging.The standard curves of streptomycin were all linear in the range of 0.10~3.20 u /mL (r=0.9981,n=6) .The RSD for repetition of the concentrations (0.20,0.80,1.60u/g ) spiked with streptomycin standard solution for milk was 1.6%, 3.7%,1.2 %(n=3), respectively and these average spiked recoveries were 97.6% (n=9).This method offered a rapid ,repeatable and accurate procedure convenient for determination of streptomycin residues in milk. Key words: streptomycin;milk; microbiologic inhibition tests ;trichloroacetic acid ; freezing centrifuging