银杏叶提取液中总黄酮含量检测方案(红外光谱仪)

75 76付友珍等：近红外光谱法测定银杏叶提取液中总黄酮含量/2009年第5期 近红外光谱法测定银杏叶提取液中总黄酮含量 付友珍，王 斌，杨天鸣，孙丽英 (中南民族大学药学院，湖北武汉430074) 摘 要：应用近红外光谱技术建立了快速测定银杏叶提取液中总黄酮含量的方法。将高效液相色谱法测定的总黄酮含量作为参考标准值用于建模，考察预测残差平方和(Predictive residual error sum of square ，PRESS) 与主成分之间的关系，主成分数为2时得到 PRESS 最小；用偏最小二乘法(PLS)进行回归分析得到的回归系数为0.98206、交叉验证结果的回归系数为0.96322，表明预测模型具有良好的稳定性。高效液相色谱法测定的银杏叶提取液中总黄酮含量与本方法的预测值之间存在良好的线性关系，t检验结果表明，两种方法测得的总黄酮含量无显著性差异。本方法快速、简便，能准确地预测银杏叶提取液中总黄酮的含量。 关键词：银杏叶；总黄酮；偏最小二乘法(PLS)；回归分析；近红外光谱 中图分类号：O657.33 R 262. 5 文献标识码：A 文章编号：1672-5425(2009)05-0075-04 银杏(Ginkgo biloba L.)，又名公孙树，主产中国，为古代遗子植物，在地球上已存在约2亿年，素有“天然活化石”之称。《本草纲目》记载其性甘、苦涩，归心经、肺经，功能敛肺、平喘、活血化瘀、止痛，可用于治疗肺虚咳喘、冠心病、心绞痛、高血脂等。 近十几年来国内外掀起了研究银杏叶提取物(EGB)的热潮。迄今为止，已从银杏叶中分离出的极性和非极性化合物有黄酮类化合物、萜内酯、有机酸、烷基酚等160多种物质。大量的药理实验结果显示，在多种化学活性成分中，酮类和萜内酯是银杏叶发挥独特药理活性的有效成分，因而成为银杏叶和植物药剂质量标准化的重要依据。银杏叶中黄酮类物质，具有活血化瘀作用，临床上主要用于动脉硬化及高血压所致的冠状动脉供血不全、心绞痛、心肌梗塞、脑栓塞、脑血管痉挛等心脑血管疾病的治疗[23] 目前，国内外对于银杏叶成分的测定方法报道较多，大多是直接测定桶皮素、芦丁的含量，然后经转换因子计算，间接得到总黄酮苷含量4。 作者应用近红外光谱指纹图谱技术和化学计量学软件建立了快速测定银杏叶提取液中总黄酮含量的方法，大大提高了分析效率，节约了分析成本，为银杏叶及其制剂质量的有效控制提供了简便快速、可靠的分析方法。 1 实验 1.1 材料、试剂与仪器 银杏叶采自中南民族大学校园内，经洗涤、干燥、粉碎、过筛后备用。 檞皮素对照品(100081-200406)，中国生物制品检验所，干燥后备用。 甲醇，95%乙醇，磷酸；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，实验用水为高纯水。 DFF-100型手提式高速中药粉碎机，温岭市林大机械有限公司；200目标准检验筛(孔径0.074 mm)，浙江上虞五四纱筛厂；DZF-6021 型真空干燥箱，上海一恒科技仪器有限公司；电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；CW-2000型超声-微波协同萃取仪，上海新拓微波溶样测试技术有限公司；L-7000型高效液相色谱仪，日立公司；L-7455型 DAD 检测器；Anta-ris I型傅立叶变换近红外光谱仪，美国Thermo Nico-let公司；In GaAs 检测器和石英样品杯；Result 软件用于光谱的采集，TQ Analyst 6.2智能分析软件用于处理采集的光谱数据。 1.2 方法 1.2.1 HPLC法 1.2.1.1 供试品溶液制备 ( 收稿日期：2008-12-30 ) ( 作者简介：付友珍(1983-)，女，湖北随州人，硕士研究生，研究方向：药物分析；通讯联系人：杨天鸣，副教授。E mail：tm28y @ya- hoo.com.cn 。 ) 称取适量银杏叶粉末，用50%乙醇浸泡过夜，采用超声-微波协同萃取法提取，去除滤渣后得纯净提取液。分别吸取提取液3.00mL、4. 00 mL 、5.00mL、6.00 mL 、7.00mL，用50%乙醇稀释至25mL，制成5个浓度梯度的供试品溶液，每种供试品溶液分成4份备用。 1.2.1.2 标准溶液制备 精密称取一定量量皮素对照品(含量97.3%)，用适量甲醇溶解并定容，制成浓度300ug·mL的标准溶液备用。 1.2. 1. 3 色谱条件 HPLC色谱条件：固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为甲醇-水(0.4%磷酸)=50 ：50，流速0.8mL ·min，进样量20uL，柱温为室温，检测波长370 nm。 1.2.1.4 标准曲线的绘制 精密量取皮素标准溶液 0.40 mL、0. 80 mL、1. 20 mL 、1. 60 mL 、2.00mL分别置于10 mL 容量瓶中并用甲醇稀释至刻度。在1.2.1.3色谱条件下依次进样3次，计算峰面积，以峰面积平均值A对样品浓度c(ugmL)进行线性回归，结果见表1。 表1 HPLC法标准曲线回归结果 Tab 1 The regression result of standard curve of HPLC method 对照品 回归方程 线性范围/pg·mL R2 RSD/% 皮素A=55282.9c-21412.9 12.61~63.05 0. 9991 1.1 1. 2. 1.5 样品的测定 将供试品溶液用0.22pm 微孔滤膜过滤，滤液按1.2.1.3色谱条件用高效液相色谱仪进行测定，按单一对照品法5]测定银杏叶供试品溶液中的总黄酮含量。 总黄酮含量=C量皮素 X2. 51 1.2.2 近红外光谱法 1.2.2.1 近红外指纹图谱采集 将供试品溶液盛入样品池内，使用Antaris Ⅱ型傅立叶变换近红外光谱仪的透射附件采集近红外光谱图。采集条件：采集光谱范围为10000~4000cm，扫描次数为16次，分辨率为8cm。每份样品测定3次，取其平均光谱用于数据处理。 1.2. 2.2 预测数学模型建立方法 将高效液相色谱法测定的供试品溶液总黄酮含量作为参考标准值用于建模，用TQ Analyst 6.2软件处理所获得的近红外光谱数据，建立相应的预测数学模 型并进行优化。 2 结果与讨论 2.1 近红外光谱测定结果 不同总黄酮含量的供试品溶液的近红外图谱如图1所示。 图1 不同总黄酮含量的供试品溶液的近红外图谱 Fig.1 NIR spectra of samples with differenttotal flavonoids contents 2.2 光谱波段的选择 采用不同光谱范围建立预测模型。结果显示，当选取的波长范围为4451~4289 cm'时，所建立模型的交叉验证标准差(Root of mean squared error of cross vali-dation ， RMSECV)最小。因而，选择该波段的光谱数据建立银杏叶提取液中总黄酮含量预测模型。 2.3 主成分分析 用主成分分析(PCA)处理近红外光谱数据可观察到数据的主要趋势。考察预测残差平方和(Predictiveresidual error sum of square，PRESS)与主成分数间的关系，结果如图2所示。 图2 PRESS 与主成分数关系图 Fig.2 The relative graph of PRESS and principal components 由图2可知，最佳主成分数为2，此时 PRESS 最小。 2.4 偏最小二乘法回归分析 将高效液相色谱法测定的供试品溶液总黄酮含量作为参考标准值用于建模。采用偏最小二乘法(PLS) 回归建立模型时，在20个样本中随机选择7个样本作为验证集(Validation)、其余13个样本作为校准集(Calibration)；用回归系数R、校正标准差(RMSEC)、 图3 PLS回归分析结果 预测标准差(RMSEP)来评价校准集；用交叉验证标准差(RMSECV)和回归系数R来评价验证集。PLS回归分析结果见图3、交叉验证结果见图4. 由图3可知，本方法所建立模型的回归系数为O. 98206、校正标准差为1.97、预测标准差为3.40。表明模型具有很好的线性和预测能力。 图4 交叉验证结果 Fig.4 The result of cross validation 由图4可知，交叉验证结果的回归系数为0.96322，交叉验证标准差为5.04。表明模型具有良好的稳定性。 经过建模计算，所得结果与 HPLC测定结果相比较，结果见表2。 表2 总黄酮含量测定结果比较/ug·mL Tab 2 The comparison of determining resultsof total flavonoids content/ug·mL 样品编号 1# 2# 3# 4# 5# HPLC法 32.14 42.76 46.46 51.47 61.76 近红外光谱法 31.91 43.70 49.63 55.23 59.16 偏差 -0.23 -0.94 3.16 3.77 -2.60 由表2可知，偏差在0.05%~0.63%之间。 对HPLC法和近红外光谱法得到的结果进行t检验(α=0.05)，结果见表3. Tab 3 The results of ttest 平均值x 标准偏差s 自由度f t值 - 1.09 2. 59 4 -0. 87 α=0.05时，查表得t(0.05，4)=2.57，由表3可知，t

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