高效表达与蛋白制备

29/03/2015 29/03/2015高效研发与便捷质控 高效表达与蛋白制备 ——来自默克密理博生命科学部的解决方案 何煜 (Allen He) March 2015 默克集团公司简介 M 世界上历史最悠久的医药化工企业，其历史可追溯到1668年，总部位于德国达姆斯达特在64个国家拥有分支机构，员工近40000人2010年收购 Millipore- Merck Millipore2011年收购清大天一 默克密理博生命科学部生物制药工艺部实验室纯水部实验室基础部 2014年9月22日宣布收购Sigma加强在生命科学领域的领先地位 默克密理博生命科学部高品质产品支持生物制药研发与产品质量监控高品质的产品支持获得可靠的数据 M Calbiochem 小分子：大智慧 基础研究与治疗药物开发 以信号通路抑制剂/小分子化合物著称，与大药厂协议合作 MAP Kinase Signaling Pathway ·生物学功能信息详细、明确 ·每月推出最新最热的新小分子 ·激酶抑制剂文库 。干细胞命运调控小分子文库 ·特定信号通路抑制剂panel动物实验级大包装 ELISpot技术在诊断和药物评估中日渐重要 M MultiScreen@|'ELISpot板 2 5 YYYYY YYYYY YYYYY YYYYY 888888 30，000 cells/well ·单细胞免疫检测： T/B cell 灵敏度达1/106， 比ELISA和流式细胞术都显著高；高通量、低成本 ·疫苗研发与评估，免疫疾病(糖尿病、风湿、红斑狼疮等)及结核等诊断，器官移植评估 ·标准化极为重要 第一部分 重要原则：选择合适的表达平台(宿主) M 表达什么?片段优化——-噬菌体展示系统 原核表达：经典大肠杆菌-pET系统 M 启动子：带有T7Lac启动子的pET系列表达载体成为金标 经典案例：IL-2的工业化生产 M 经典案例：IL-3可溶性改善 Duet： 在一个表达系统中实现1-8个蛋白共同表达M 宿主细胞 M 增加蛋白活性/可溶性的策略： Origami M 二硫键的正确形成与折叠 Tissue plasminogen activator (9 disulfide bonds) was expressed in three different hosts. 10 ug of soluble protein was spotted onto fibrin agarose plates and incubated for 24 h at 37°C. Zone of clearing measures biological activity of tPA. 获得全长蛋白，提高产量： Rosetta M 克服稀有密码子导致的低产与不整问题 替代超声波的抽提试剂大幅提高活性蛋白产量 M 亲和纯化 M 获得高产完整一致的目的蛋白 M ·表达全长蛋白 ·减少蛋白降解或被剪切 ·减少核酸干扰 ·特异性好的亲和纯化方法 ·合适的树脂用量 Viscosity reduction by Benzonase M 应用举例：透析换液-i——以抗体标记为例 M 操作步骤 透析法换液 Amicon Pro 缓冲液置换 过夜 Pro 15min FITC标记 3h 30min 移除未标记的FITC并换液 过夜 15min 总用时 3天 1h 抗体得率 39% 72% 高通量诱导表达、抽提、纯化策略 昆虫细胞表达系统成为受人关注的首选平台M 基因组大：外源插入片段可达12kb；可同时表达多个基因 能获得重组蛋白高水平的表达：最高可达到细胞总蛋白的50%有较完善的翻译后加工过程：绝大多数产物具有生物活性可用于蛋白晶体研究 技术简便、生产成本低、无病原性：遗传学上是安全的，用于医药产品开发 但是，要评估昆虫细胞表达平台是否对特定蛋白合适，我们曾经需要1个月做准备 ——-满足各种课题设计之需 蛋白激酶同源异构体表达实验 M 将多种突变基因克隆到pIEx"-1Ek/LIC载体：：1天 纯化扩增了的质粒 采用昆虫细胞专用GeneJuiceTM 转染试剂将重组质粒转染10ml Sf9悬浮培养细胞 转染48小时后以昆虫细胞专用PopCulture@抽提试剂裂解细胞：2-3天 1用Ni-NTA His·Bind@亲和纯化重组蛋白从500ul样品中取10pl跑10-20%梯度胶分析：1天 ——共1周 plEx-1 Purified protein kinases from plExTM-1 co Bsu36 几种常见的重组杆状病毒制备系统的比较 M BacMagicTM3产量为目前所有产品中最高 M >BacMagicTM DNA在昆虫细胞中与基因供体质粒同源重组，不需要繁琐耗时的噬斑纯化操作； >BacMagic-3病毒骨架删除5个非必需基因和有害基因，以提高目的蛋白产量、翻译后加工和活性 昆虫表达系统易于实现自动化规模放大 M M (Pfizer Global Research and Development) M UCOE@哺乳动物细胞基因表达技术 泛染色质开放元件 『Ubiquitous Chromatin Opening Element (UCOE)』因影响染色质结构而使稳定转染细胞中的外源基因表达得到有效改善和提高。 UCOE是一个小的DNA片段，源于看家基因的调控区域；UCOE有效防止基因沉默，不论整合到染色质什么位置，目的基因都能得到持续稳定、高水平表达。受其控制的基因能很好地克服“位置效应”而保持活跃的转录状态，从而使目的蛋白能在宿主细胞中获得最高产的表表。 独特的优势： ·30天内获得g/L级目的蛋白，发酵规模达100L(是传统载体的20倍以上)·筛选稳定表达克隆时间大大缩短(1-2个月) ·与CHO细胞、CMV启动子一起构成更优化的蛋白工业化生产体系 ·细胞稳定传代达130代以上 ·用于抗体、EPO、GPCRs、酶、细胞因子等工业化生产 载体的结构： UCOE@ Human 4 kb Puro M ori (pMB1) HindIII (97) FseI (5309) gpCMV promoter UCOE Hu-P sequence landmarks Murine phosphoglycerate kinase (PGK) promoter 5646-6156 Puromycin coding region 6170-6746 Complement Component 2 (C2) poly A 6825-7082 B-lactamase (Amp) promoter 7188-7433 p-lactamase coding region (Amp) 7434-8291 Origin of replication (ori)(pMB1) 8511-9135 F(4kh) UCOE (4kb) 130-4200 Guinea Pig CMV promoter 4389-5184 Multiple Cloning Region (MCR) 5309-5316 SV40 poly A 5405-5630 M UCOE@表达技术将分泌型EPO蛋白产量提高9-56倍。在外源基因启动子5'端上游加上一个UCOE@元件，即获得了20倍以上的产量提高。CHO-K1细胞经转染和抗生素筛选、培养，评估克隆产量。 快速生产单克隆抗体：3x107 CHO-S细胞转染90 pg抗体表达质粒。经抗生素筛选，培养并放大到10L。在第16天添加少量新鲜培养物(+opti)。经评估，带UCOE@件件的表达质粒抗体产量得到显著提高。 M UCOER表达效果：更便于发现高产克隆 因为多数细胞均表现稳定高产，采用UCOE@技术相对于传统的大海捞针式的筛选高产克隆显得简便多了。两个载体分别带有抗体的重链和轻链基因，共转染CHO-S细胞，经抗生素筛选，随机选取96个克隆进行抗体产量评估。 第二部分 M 蛋白样品操作工具简介 Merck Millipore 超滤装置 M Amicon Ultra 0.5 Amicon Ultra 2 Amicon Ultra 4 Amicon Ultra 15 Centricon Plus-70 Ultrafree MC/CL Stirred Cell Solvent-ResistantStirred Cells M