食品和生物体中多氯联苯检测方案(液质联用仪)

2实验条件 结果与讨论 简介 多氯联苯(PCBs)是一类耐用性极强的工业化学品，主要用于变压器、电容器、油墨、涂料、农药、粉尘控制，以及绝缘液体的制造。据估计，全球的 PCBs 总产量已达一百五十万吨。在1930至1977年间，美国是多氯联苯单一最大生产国，生产了超过六十万吨的 PCBs。欧洲区紧随其后，至1984年的产出为四十五万吨。 多氯联苯包括209种不同的单体(同系物)，对健康有不同的影响。虽然美国早在1977年就禁止生产PCBs， 用PCBs制造的产品却仍然在使用。由于多氯联苯在环境中降解缓慢，所以它们可以被气流带到了地球的各个角落。PCBs 已经污染了地球上所有动物及人类的身体。 《关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约》将 PCBs 列为世界上已知对人体和环境有害的十二种最危险的化合物之一。尽管体内二恶英水平在缓慢稳定的下降，反映出多种防止扩散的努力总的来说取得了一定效果，然而PCBs 污染水平在全球来讲预计不会发生变化 (2007 东京二恶英研讨会)。对二恶英水平的监测作为斯德哥尔摩公约的工作项目还将继续多年，会涉及大量样品的采集，尤其是对于危险的类二恶英 PCBs (dl-PCB)来说。值得一提的是共面 dl-PCB，即非间位取代的PCB，由于具有与2，3，7，8-TCDD类似的毒性，成为食品安全控制的焦点。dl-PCBs 也对样品毒性当量(TEQ)值有显著贡献。 本应用文章详细记录了一种使用Thermo Scientific TSQQuantum XLS三重四极杆质谱仪，对环境、食品和生物样品中的 PCB 进行定量分析的快速、可靠，并且具有高选择性的痕量筛查方法。本方法的分析策略近似于美国国家环境保护局(USEPA) 已建立的方法1668A。 由于分析响应有差异，每种氯代物都是根据各自同位素标记的内标化合物进行定量。这样保证了最佳的分析准确性和同类化合物相似性。内标化合物用用C对联苯骨架进行了标记，共计十二个标记位点。13C标记的 PCB被加入到样品中，以保证在分析过程中实现准确的鉴定并对原始(未标记)化合物浓度进行校正。 该方法通常被称为“同位素稀释定量法”。本文在 IUPAC同类编号后面加“L"来表示标记的化合物；例如101L表示五氯联苯同类物101带同位素标记的形式。 仪器设置 样品分析是利用 TSQ Quantum XLSTM GC-MS/MS 系统进行的，本系统配备了 Thermo Scientific TRACE GC Ultra 气相色谱仪。 TRACE GC UltralM 配置了分流/不分流进样口，进样器采用的是 Thermo Scientific TriPlus AS 液态自动进样器。毛细管柱采用的是30米长的 Thermo Scientific TRACE TR-Dioxin 5MS 柱(5%苯基薄膜)，内径为 0.25mm，薄膜厚度为 0.10 pm。表一记录了气相色谱、自动进样器，和质谱仪的各项参数。 表 1.TSQ Quantum XLS、TRACE GC UItra， 及 TriPlus 自动进样器仪器设置 TRACE GC UItra TriPlus自动进样器 TSQ Quantum XLS 离子源温度： 240℃ 离子化方式： El，40 eV 发射电流： 100 pA Q1分辨率： 0.7 Da Q3分辨率： 0.7 Da 碰撞气： 氩气，2.0mTorr 碰撞气能量： 22eV 样品测量 USEPA 方法 1668 描述了一种测定PCB 同类物的方法。 ….[方法 1668]是由美国国家环境保护局的 (EPA)科学与技术办公室开发的，专门针对世界卫生组织(WHO)指定的剧毒多氯联苯(PCB)同类物的特异性检测方法。方法1668的修正稿A里已经包含了超过150种氯代联苯(CB)同类物的特异性检测方法。有毒 PCB 以及氯代PCB的起始和终止水平是用同位素稀释高分辨气相色谱/高分辨质谱 (HRGC/HRMS) 测定的。其它CB用的是内标法HRGC/HRMS。方法1668A 适用于水相、固相、组织，以及多相样品基质。 本应用使用了商用 EPA 1668 标准品((加拿大安大略省贵湖市惠灵顿)。68A-CVS 是 USEPA 方法1668修正稿A，HRGC/HRMS 方法常用的校准溶液。每个 PCB 氯代度的所有内标 (ISTD) 都是含12个1C标记的相似物。样品和内标的处理以及分析策略完全遵照 EPA 方法 1668A 执行。 TSQ Quantum XLS SRM 设置 虽然 USEPA 方法1668要求被分析物是“...经气相色谱分离并由高分辨 (R10，000)质谱仪检出，[且包含]两个准确质荷比值…并且在提前确定的保留时间窗口中从头到尾对每个氯代水平进行监测”，本应用文章发展的方法实际上是利用了三重四极杆质谱仪作为 HRMS的替代方案，TSQ Quantum XLS 的四极杆为双曲面四级杆，能够有效提高选择性。根据欧盟委员会指令96/23/EC 中有关分析方法表现的排名， GC-MS/MS 方法的识别点数与 HRMS 相似或更高，尤其是当使用基于 MS/MS 的独立离子对时(表2)。 表2. GC/MS 分析方法获得的识别点数范例(n=整数)。*标识的为本文所述方法。 Technique GC-MS(El or CI) n n GC-MS (El and CI) 2 (EI)+2 (CI) 4 GC-MS/MS 1 precursor and 2 product ions 4 GC-MS/MS* 2 precursor ions， each 5 with 1 product ion HRMS n 2n 根据欧盟委员会指令96/23/EC， 有机物残留或污染物适用的确认方法必须是基于全扫技术或“若方法不记录全扫谱图，则需要至少四个识别点(多氯联苯，.二恶英，呋喃等)”，即常见的目标化合物多离子检测方法(MID)。通过使用来自两个 PCB一级离子的二级质谱离子对，并为每个氯代度都进行特异性的子离子检测，本方法的测量体系遵循了欧盟委员会指令 96/23/EC， 并为每种PCB单体化合物提供了5个识别点。 我们监测的是基于分子离子(C，2H1035CI，)相对于CI同位素即(C2H10x35C37CI) 经碰撞诱导解离 (CID)碎裂过程形成的丢失了两个氯的二级离子的离子对(表3)。同位素内标也用相同方法检测，不过，由于含有12个13C标记，所以有12道尔顿的质量位移。 表3.PCB 的 SRM 数据采集体系，对每个一级离子都进行两个子离子的 MID 检测。PCB的名称术语采自 EPA 方法1668，并反映了氯代水平。 PCB Precursor 1 Precursor 2 Product1 Product 2 m/z m/z m/z m/z MoCB 188.04 190.04 153.04 153.04 MoCB ISTD 200.08 202.08 165.10 165.10 DiCB 222.00 224.00 152.06 152.06 DiCB ISTD 234.04 236.04 164.10 164.10 TrCB 255.96 257.96 186.02 186.02 TrCB ISTD 268.00 270.00 198.02 198.02 TeCB 289.92 291.92 219.98 219.98 TeCB ISTD 301.96 303.96 232.02 232.02 PeCB 323.90 325.90 253.95 255.95 PeCB ISTD 335.92 337.92 265.99 267.99 HxCB 357.80 359.80 287.90 289.95 HxCB ISTD 369.90 371.90 299.51 301.95 HpCB 391.80 393.80 321.90 323.90 HpCB ISTD 403.80 405.80 333.90 335.90 OcCB 427.80 429.80 357.80 357.80 OcCB ISTD 439.80 441.80 369.90 369.90 NoCB 461.70 463.70 391.80 393.80 NoCB ISTD 473.80 475.80 403.80 405.80 DeCB 495.70 497.70 425.80 427.80 DeCB ISTD 507.70 509.70 437.80 439.80 需要注明的是，在选择一级离子时，只有单一同位素的 HxCB的分子离子M*，例如 m/z 357.80CHCl6，会生成特异性的二级离子。同位素峰中的下一个离子， m/z359.80，携带一个CI，统计上来说会生成两个二级离子，其中只有一个带有CI。这种同位素效应导致二级离子丰度会随着氯代程度升高而降低。 选择离子监测 (SRM) 模式下的分析序列使用了六个(6)保留时间窗口以及有重叠的质量区间来检测所有十个氯代程度(LOC)。除了时段1，总要有两个氯代程度是被平行监测的。这种设置是由于相邻氯代程度的PCB同类物总是交替洗脱的。每个 SRM 分析时段里进行分析的质量数之多显示出 TSQ Quantum XLS 在进行多组分平行检测任务时的能达到的速度和容量。表4和5详细列出了 SRM 时段和设置。 图1.一个PCB标准品从一氯代到五氯代PCB的提取离子色谱图(柱上1pg) 图2.一个PCB标准品从六氯代到十氯代 PCB的提取离子色谱图(柱上1pg) 图3.标样中的五氯-PCB同类物，用两个独立的 SRM 离子对分别检测目标化合物(上上)和同位素标记的(下图)PCB同类物104，123，118，114，105，126。 ISTD 谱图也显示出 101L和111L成分。 方法开发 所有 PCB同系物的每个氯代化合物都通过两个独立的SRM 离子对进行检测。每个离子对使用分子离子的不同氯同位素峰作为一级离子。数据采集是根据表4和5中列出的 SRM 详表进行的。TSQ Quantum XLS 得到的 MS/MS 结果如图1和2所示。图1列出了从一氯代到五氯代 PCB 的谱图，而图2列出了从六氯代到十氯代联二苯的谱图。这些结果是使用表3中列出的 SRM 离子对参数得到的。 图1和2中的质谱图使用了每个化合物丰度最高的一级离 子来示明氯代度的顺序。所有同类物都能用每个 SRM 离 子对实现高响应的检测。观察到的信号丰度的降低是由 于当进样量为柱上 1 pg 时， PCB 分子离子的同位素峰浓度 根据统计学规律产生的降低。 图3比较了一个氯代度的两个独立 SRM 离子对。顶部的质谱图代表源于未标记的五氯代PCB同类物的质荷比为323.90和325.90的一级离子，而底部质谱图则是同位素标记的内标化合物(质荷比为335.92和337.92的一级离子)。这一比较证明了不同SRM离子对之间谱图是高度吻合的，从而支持了对 PCB的识别的可靠性。 TSQ Quantum XLS 三重四极杆质谱仪在标准分辨率模式下(0.7Da峰宽)得到的这些 SRM 质谱图与用用气相色谱和高分辨质谱仪(GC-HRMS)得到的数据显示出很好的相关度。如图3所示的五氯代PCB的情况，通过使用基于两个不同一级离子的独立离子对，本 TSQ Quantum XLS 方法能够达到欧盟指令所要求的高确定性。而即便在每个SRM 窗口中都平行监测两个氯代度时， TSQ Quantum XLS 分析器的高运行速度也能为每个色谱峰提供至少6到8个数据点。这使得色谱峰的积分和定量的结果都十十可靠。 图4.血液样品中dl- 五氯代 PCB 图5.牛奶样品中dl-五氯代 PCB 图6.蛋黄样品中 dl-五氯代PCB 图7.绿卷心菜样品中 dl-五氯代 PCB 在复杂样品基质中的表现 为了在复杂基质样品中验证本色谱和质谱方法，我们制备了若干种非常具挑战性的样品基质。 TSQ Quantum XLS在这些样品的分析中显示出极佳的灵敏度、选择性，和耐用性，如图4至图7所示。这些结果使我们得以比较在涵盖了血液、牛奶、蛋黄，和绿卷心菜等基质的样品中得到的五氯代 PCB 的分析结果。TSQ Quantum XLS 在所有这些基质中都能够提供干净、无背景的离子流图。在比较这些基质样品和图1至图3所示的标准品时，本方法的选择性更为显而易见。哪怕面对复杂样品基质，例如血液样品(图4)和绿卷心菜样品(图7)中，也没有观察到任何背景信号的升高。 经与标准品检测结果的比对，样品中的 PCB 浓度水平大致在中等含量飞克(fg)至低含量皮克(pg)区间。未标记PCB的检出浓度为0.2和1.0 pg/uL，所有加入的1C标记的内标浓度为 100 pg/pL。 TSQ Quantum XLS 的选择性实质上消除了背景干扰，，可以获得较低的方法检出限，和可靠的定量结果，和化合物的准确鉴定。 结论 ( Thermo Scientific TSQ Quantum XLS 有利于复杂基质样品中低 含量PCB 的筛查和定量，并能够是供高度可靠的结果。 ) ( 本分析方法遵循 USEPA 方法 166 8 A，使用了同位素稀释定量法。对复杂基质样品的检测结果所示，加入℃-标记的内标组分能够实现高度可靠的检出。 ) 确证方法提供了被分析物的化学结构信息。拥有独特双曲面四极杆技术的 TSQ Quantum XLS为包括鸡蛋、牛奶、卷心菜和血液等复杂基质中低含量 PCB样品的检测提供了无与伦比的高选择性。在 H-SRM 模式下运行 TSQ QuantumXLS时，能够观察到在使用高分辨质谱仪(如扇形磁场质谱仪)时观察到的PCB典型分布模式。 本方法提出的使用两个一级离子并子测不同 SRM 离子对的 MS/MS 测量方法，是在各种复杂基质中筛查 PCB的有效解决方案。对于食品管控来说，配备 TSQ Quantum XLS的 GC-MS/MS 超出当前欧盟指令至少四个识别点，本文描述的方法提供了五个识别点。 对第三方及政府监控实验室来说， TSQ Quantum XLS 同样能够提供复杂基质样品高样品通量的高生产率方案。因为使用了简便的样品前处理方法， TSQ Quantum XLS 在为 PCB痕量分析提供无与伦比的分析表现，同时还有附加的经济优势。 ( G e neral information about PCBs， see www.wikipedia.org ) ( 12 F i edler， H . ， Polychlorinated B iphenyls (PCBs)： U ses a n d Environmental Releases， U N EP Persistent Organic Pol l utants. www.chem.unep.ch/pops/POPs_Inc/proceedings/bangkok/ FIEDLER1.html ) ( 3. Turner， W.E.； Welch， S.M.； et al.， Instrumental approaches forimproving the detection limit for selected PCDD congeners insamples from the general U.S. population as background levelscontinue to d ecline， Proceedings of th e Dioxin Conference， Oslo2006. ) ( 4 Method 1668， Revision A ： C hlorinated Biphenyl Congenersin Water， So i l ， Sediment ， an d Tissu e by HRGC/HRMS， UnitedStates Environmental Protection Agency， Office of Water， EPANo.EPA-821-R-00-002， December 1999 ) ( 5 EU Commission Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the in t erpretation of results， 12 August 2 002， see http：//eur-/ex.europa.eu ) Segment 1 2 3 4 5 6 Duration (min) 9.85 2.60 3.30 4.33 6.03 5.89 Start Time (min) 0 9.85 12.65 15.75 20.08 26.11 Segment 2： Precursor (m/z) Product (m/z) Width (m/z) Time (s) 325.90 222.00 152.06 0.002 0.080 335.92 224.00 152.06 0.002 0.080 337.92 234.04 164.10 0.002 0.030 357.80 236.04 164.10 0.002 0.030 359.80 255.96 186.02 0.002 0.080 369.90 257.96 186.02 0.002 0.080 371.90 268.00 198.02 0.002 0.030 391.80 270.00 198.02 0.002 0.030 393.80 323.90 0.002 0.070 403.80 333.90 0.002 0.030 405.80 335.90 0.002 0.030 427.80 357.80 0.002 0.070 429.80 357.80 0.002 0.070 439.80 369.90 0.002 0.030 441.80 369.90 0.002 0.030 255.96 186.02 0.002 0.080 257.96 186.02 0.002 0.080 268.00 198.02 0.002 0.030 270.00 198.02 0.002 0.030 289.92 219.98 0.002 0.080 291.92 219.98 0.002 0.080 301.96 232.02 0.002 0.030 303.96 232.02 0.002 0.030 323.90 253.95 0.002 0.080 325.90 255.95 0.002 0.080 335.92 265.99 0.002 0.030 337.92 267.99 0.002 0.030 289.92 219.98 0.002 0.080 291.92 219.98 0.002 0.080 301.96 232.02 0.002 0.030 303.96 232.02 0.002 0.030 323.90 253.95 0.002 0.080 325.90 255.95 0.002 0.080 335.92 265.99 0.002 0.030 337.92 267.99 0.002 0.030 357.80 287.90 0.002 0.080 359.80 289.90 0.002 0.080 369.90 299.95 0.002 0.030 371.90 301.95 0.002 0.030 赛默飞世尔科技(中国)有限公司 免费服务热线：8008105118 Segment 6： Precursor (m/z) Product (m/z) Width (m/z) Time (s) 391.80 321.90 0.002 0.070 393.80 323.90 0.002 0.070 403.80 333.90 0.002 0.030 405.80 335.90 0.002 0.030 427.80 357.80 0.002 0.070 429.80 357.80 0.002 0.070 439.80 369.90 0.002 0.030 441.80 369.90 0.002 0.030 461.70 391.80 0.002 0.070 463.70 393.80 0.002 0.070 473.80 403.80 0.002 0.030 475.80 405.80 0.002 0.030 495.70 425.80 0.002 0.070 497.70 427.80 0.002 0.070 507.70 437.80 0.002 0.030 509.70 439.80 0.002 0.030 原始数据采集使用 Thermo Scientific TSQ Quantum GC。 ThermoScientific Quantum XLS 的表现通常达到或超过这些结果。 ThermoFisherSCIENTIFIC (支持手机用户)AN_CM