水产品中兽药残留检测方案

高效液相色谱法检测海水养殖环境中喹诺酮类药物残留 摘要：建立了一种养殖海水中诺氟沙星、环丙沙星争恩诺沙星3种喹诺酮类抗生素残留量的高效液相色谱一荧光测定方法。水样经稀盐酸调PH后经HLB固相萃取柱富集、净化，用外标法定量。结果表明，诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星检出限分别是2、1和1 gg／L，定量限分别是6．6、3．3和3．3 ug／L，添加浓度为10、20和50 ug／L时，3种物质的回收率为71．9％～85．3％，批内变异系数≤10％，批问变异系数≤7％。利用该方法对黄海沿岸部分养殖场及近岸海水(北起36。40．303 7 N，1210 8．939’E；南至35。39．36’N，119。52．433’E)进行分析，诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星的检出质量浓度分别为6．20～982、55．2和11．6～55．4 ug／L。实验结果表明，该方法灵敏度高，重现性好，适用于养殖海水中诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星的检测。 关键词 喹诺酮类抗生素 高效液相色谱 固相萃取 海水 喹诺酮类(Quinolones，QNs)抗生素是一族人工合成的新型杀菌性抗菌药物，具有抗菌谱广、抗菌活性强、与其他抗菌药物无交叉耐药性以及毒副作用小的特点，主要用于水生动物弧菌病、链球菌病、水霉病和寄生性疾病的防治，其中诺氟沙星(Norfloxacin，NF)、环丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)和恩诺沙星(Enrofloxacin，EN)等被广泛应用于水产养殖中。目前，我国针对这类抗生素的研究主要集中于水产品中检测技术和代谢动力学的研究(方星星等2004；钱云云等2007；曲晓荣等2007；王洪艳等2007；何平等2008；李娜等2009)。 近年来我国水产养殖业发展迅速，产量和规模不断增加，但由于环境恶化和养殖模式的改变，水生动物疾病频发。为了预防和治疗水生动物疾病，抗生素被广泛应用在水产养殖中。但研究表明，所使用的抗生素仅20％"-30％被鱼类吸收，大部分进入环境中(Samuelsen 1989)，而这部分抗生素再次进入食物链，可能导致养殖环境中病菌耐药性的产生，导致二次污染(Hamscher et a1． 2002)。这不仅影响到水产养殖业的健康发展，而且还威胁着生态环境的安全。因此，需要建立水环境中这类药物的检测方法。 高效液相色谱法测定海水中环丙沙星含量的方法，并测定其衰减度，在O～6 h内环丙沙星衰减很快，但6 h后其浓度基本稳定，同时还发现环丙沙星在海水中衰减程度随盐度的增加而加快。利用高效液相色谱法分析城市河水中的多种抗生素，水样由稀盐酸调pH至4．2后经HLB固相萃取，用内标法通过HPLC进行定量分析。对海水养殖环境中喹诺酮类残留量的检测研究报道较少。为减少海水养殖环境中盐分、浮游生物及微小颗粒对喹诺酮类测定存在的干扰，本研究采用固相萃取技术对海水中的3种喹诺酮类抗生素进行富集和净化处理，采用高效液相色谱荧光检测器测定，建立了诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星3种喹诺酮类抗生素残留检测方法，并测试了青岛附近黄海海水养殖区(从36。40．303’N，121。8．939’E至35。39．36 7N，119。52．433 7E)海水中的喹诺酮的含量，为海水中药物的生态风险评估提供依据。 1材料与方法 1．1海水样品 海水样品采自黄海近岸海水养殖区，包括5个采样点(图1)：山东省海阳市大阎家镇某半滑舌鳎养殖场；山东省即墨市鳌山卫镇某大菱鲆养殖场；青岛市太平角海区；青岛市红岛滩涂养殖区；山东省胶南市琅琊镇某海参养殖场。分别用玻璃取样瓶在每个采样点采集500 ml表层海水，4℃密封保存，经0．45um醋酸纤维滤 膜水相滤膜过滤后使用。 1．2仪器和试剂 海能LC7000型高效液相色谱仪，配LC7070荧光检测器；VisiprepTM-DL型固相萃取装置(Supeleo)；漩涡混合器(德国IKA仪器公司)；KQ-600DE型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Milli—Q超纯水器(Milli—pore公司)；Laborota400型旋转蒸发器(Heidoplh公司)；PHS-3C精密pH计(雷磁仪器厂)；OasisHLB固相萃取小柱(3 ml／60mg，Waters公司)。 标准品和试剂：诺氟沙星标准品(含量≥99．8％)、环丙沙星标准品(含量≥99．8％)、恩诺沙星标准品(含量≥99．8％)(美国Sigma chemical公司)；甲醇、乙腈为色谱纯；四丁基溴化铵、磷酸为分析纯；实验用水均来自Milli-Q纯水系统。 标准储备液(100 ug／m1)：准确称取诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星标准品各10．0 mg，分别用乙腈溶解并定容至100 ml棕色容量瓶中，于4℃保存(保存期不超过3个月)。 混标使用液：分别取适量各标准储备液，用流动相稀释成浓度均为1．0ug／ml的混合标准工作使用液， 4℃保存。 0．01 mol／L四丁基溴化铵溶液(0．01 mol／L)：精确称取3．22 g四丁基溴化铵，用水溶解并定容至1 000ml棕色容量瓶中，用磷酸调pH至3．1。 1．3方法 1．3．1提取方法 取水样60 m1，用稀盐酸调pH值至4．0，通过HLB固相萃取柱富集、净化。HLB柱上样之前依次用3 ml甲醇和3 ml水活化。水样过柱流速控制在1 ml／min以下。样品过柱后，先用2 ml水淋洗，减压抽干后用10ml甲醇洗脱至鸡心瓶中，35～40℃旋转蒸发至干。用1．0 ml流动相定容，充分涡旋溶解残渣，滤液经0．22 弘m微孔滤膜过滤，供高效液相色谱仪测定。 1．3．2测试方法 色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C／18柱(250 mmX4．6 mm)；柱温：40℃；流动相：乙腈+0．01 mol／L四丁基溴化铵(pH 3．1)=5+95(V／V)；流速：1．5 ml／min；荧光检测器：激发波长280 nm，发射波长450nm；进样量：20ul。 1．3．3标准曲线的绘制 1．3．3．1标准工作液， 准确量取混标使用液，用流动相配制成浓度为1、2、5、10、20、50和100／zg／L的系列标准工作液。 1．3．3．2绘制标准工作曲线 将绘制标准曲线所用的系列标准工作液从低浓度到高浓度依次注入液相色谱仪，按1．3．2方法进行分析。每一浓度进两针，按其所得峰面积的平均值与对应标准溶液浓度作标准曲线，得出回归方程及相关系数。 1．3．4检出限和定量限 取加标水样按“1．3．1和1．3．2”方法进行处理和分析，以3倍信噪比(S／N=3)对应浓度为分析物的最低检测浓度，以10倍信噪比(S／N=10)对应浓度为分析物的最低定量浓度。 1．3．5 回收率及变异系数的测定 取空白海水样品60 m1，添加10、20和50ug／L的混标使用液，每个添加水平设5个平行，按“1．3．1和1．3．2”的方法进行处理和分析，取峰面积值分别计算3种喹诺酮类抗生素的含量，以加入量和测定值之比计算回收率。按每个浓度各测定5个样品计算批内变异系数；每个浓度各测3批，计算批间变异系数。 2结果与讨论 2．1标准曲线 配制浓度为1、2、5、10、20、50和100ug／L 3种喹诺酮类的标准液，测定其峰面积，并做面积与浓度工作曲线(图2)。结果表明，诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星的1～100ug／L浓度与其峰面积呈良好的线性关系，其相关参数见表1。 2．2检出限和定量限 以3倍信噪IZ(S／N=3)对应浓度为分析物的最低检测浓度，3种喹诺酮类抗生素的最低检测限分别为NF 2ug／L，CIP 1ug／L和EN 1ug／L。以10倍信噪比(S／N=10)对应浓度为分析物的最低定量浓度，3种喹诺酮类抗生素的最低定量限分别为NF 6．6ug／L、CIP 3．3ug／L和EN 3．3ug／L。 2．3 回收率及变异系数的测定 取空白海水为试验对象，测定3种喹诺酮类的添加浓度在10～50弘g／L时的回收率和变异系数(表2)。回收率均在71．9％～85．3％之间，批内变异系数均≤10％，批问变异系数≤7％。 2．4实验色谱图 2．5样品测定 分析了10份采自不同海域的养殖海水，结果见表3。谭建华等(2007)利用固相萃取的方法分析了珠江广州河段的城市河水，检测到诺氟沙星和环丙沙星的质量浓度范围为0．197,'一0．510／坚g／L，说明人们日常生活中也有3种喹诺酮类抗生素；本试验对黄海沿岸部分养殖场及近岸海水分析，有养殖海水检测到3种喹诺酮类抗生素，而近岸海水未检测到3种喹诺酮类抗生素。这说明大水域生态系统由于面积大、范围广，更有利于稀释、降解抗生素。养殖海水中检出喹诺酮类抗生素的原因可能是：(1)3种喹诺酮类抗生素药物仍在使用。药物的不规范使用是导致水环境中存在检出药物的重要原因(王朋华等2008)；(2)残留在海水中的未代谢药物。水生动物用药后，药物以原形或其代谢物的形式通过粪便和尿液排到体外，继而对海水造成污染；(3)残留在海底底泥中未代谢的药物。Kiimmerer(2001)报道环丙沙星进入水体后，会被沉积物吸附，有65％进入到污泥中。 3 结论 本研究建立了一种简单、快速检测海水中喹诺酮类抗生素的分析方法。该方法对海水样品进行60～150倍的浓缩，诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星检出限分别是2、1和1 ug／L，定量限分别是6．6、3．3和3．3ug／L，添加浓度为l0、20和50 ug／L时的回收率为71．9％～85．3％，批内变异系数≤10％，批间变异系数≤7％。该方法净化效果好、操作简便、精确度高，且重复性好。