油脂中抗氧化剂检测方案

纳诺仪器nano instrumentVol.26.No.3May .2010Shanghai Nano Industrial Co.，Ltd. 安全与检测纳仪器nano instrument 油脂及油炸食品中四种抗氧化剂的同时测定 Simultaneous determination of four antioxidants in oil. fat and fried foods 张继红 周兴旺 杨代明 康绍英 ZHANGJi-hong ZHOUXing-wang YANG Dai-ming KANG Shao-ying (湖南省食品质量监督检测所，湖南长沙410002) (The Institute of Food Quality Supervision and Test in Hunan Province， Changsha， Hunan 410002， China) 摘要：建立采用高效液相色谱仪同时测定油脂及油炸食品中PG、T BHQ、BHA、BHT4种抗氧化剂的方法。样品的抗氧化剂经甲醇提取、过滤后即可直接测定。流动相为1%乙酸水溶液和甲醇，梯度洗脱，4种组分能有效分离，出峰时间在15 min 内，回收率在84.2%~99.2%之间，相对标准偏差RSD<5%。该方法简单、快速、准确，可用于油脂及油炸食品中PG、TBHQ、BHA和 BHT的同时检测。 关键词： PG；TBHQ；BH A； BHT；高效液相色谱 Abstract： A method for simultaneous det erm ination of antioxidantssu ch as PG， TBHQ， BH A and BHT in oil， fat and fried foods by re-versed phase highperform ance liquid chromatography was estab-lished. The antioxidants in the sample were extracted with metha-nol. After being filtrated， they could be determin ed by HPLC. Themobile phase was acetic acid aqueous solution and methan ol， and themethod of solvent programming elution was established. The fourcomp os iti ons were separated in 14 min. The recovery was from 84.2% to 99.2% with relative standard deviation being less than 5%.The method was simple， fast and accurate， suitable for simultaneou sdetermination for PG， TBHQ， BHA and BHT in oil， fat and friedfoods. Keywords：PG； TBHQ； BHA； BHT； HPLC 油脂及油炸食品在储存过程中，受到空气中氧气的氧化作用，引起变味、变色。为防止油脂氧化，常需要添加抗氧化剂口。食品中常用的抗氧化剂有：丁基有基茴香醚( butylat-ed hydroxyanisole， BHA)、二丁基羟基甲苯( but ylat edhydroxytoluene， BHT)、没食子酸丙酯(propylgallate， PG)、叔丁基对苯二酚(tert iary but ylhy droqninone，1TBHQ)等。但抗氧化剂的添加必须符合相关标准的限量要求(如PG 不超过 0. 1 g/kg，T BHQ、BHA、BHT的使用量均不得超过0.2g/kg)[2，过量添加会损害人体健康。 ( 作者简介：张继红(1967-)，女，湖南省食品质量监督检测所高级工 程师。Em ail： jihongzhang1967@163. com ) ( 收稿日期：2010-02-20 ) 长期以来，中国标准测定油脂及油炸食品中的抗氧化剂采用薄层法、比色法、气相色谱法等3，其操作比较繁琐，且不能实现这4种抗氧化剂的同时检测。近年来，出现了利用气相色谱和液相色谱测定食品中抗氧化剂的新方法，但都有各自的局限性：余晔等人的研究[4-71并未实现这4种抗氧化剂的同时检测；胡晓钟等人的报道[8-10操作较繁琐；岳振峰等人的方法"试剂消耗量较大，且对油炸食品的处理与国家标准的要求不一致。本试验考察了用不同的提取方法，选择适当的色谱条件以实现油脂及油炸食品中这四种抗氧化剂的同时、快速检测。 材料与方法 1.1 材料与试剂 油脂：大豆油、菜籽油、茶籽油、葵花籽油等，从企业监督抽查所得样品；实验室间比对样品(2007年7月参加国家认监委组织的实验室间比对试验所接收的样品)； 油炸食品：油炸玉米、油炸薯片，从企业监督抽查所得样品； 甲醇：色谱纯，国药化学试剂有限公司； 醋酸：优质纯，国药化学试剂有限公司； 没食子酸(纯度>98%)、叔丁基对苯二酚(纯度>98%)、丁基羟基茴香醚(纯度>96%)、二丁基羟基甲苯(纯度≥99%)标准品：美国Sigma 公司。 1.2 主要仪器 高效液相色谱仪(配制二二管阵列检测器)：SPDM20A，日本 Shimadzu 公司； 色谱柱(4.6 mm× 250 mm 不锈钢柱，填充无定型硅胶Ci键合相，粒径5Hm)：VP-ODS，日本 Shimadzu 公司； 低速离心机： LD5-10B，北京雷勃尔离心机有限公司； 漩涡混匀器：WH-90A，北京振荣科学仪器有限公司： 分析天平：BT224S，北京赛多利斯仪器系统有限公司。 1.3 方法 1.3.1 色谱条件 C18反相色谱柱4.6mm×250mm，粒径为5m，柱温25℃，检测波长280 nm。洗脱液：1%醋酸水溶液为流动相A， 甲醇为流动相B.梯度条件见表1，流动相流速为匀速变化。梯度洗脱之前以A： B= 60： 40 的流动相平衡色谱柱30 min 以上。 表1 梯度洗脱条件 Table 1 时间/ min 流量/(mL·min-1) 流动相A/% 流动相 B/% 0.01 1.000 60 40 7.50 1.000 0 100 15.00 1.000 0 100 15.50 1.000 60 40 20.00 1.000 60 40 1.3.2样品处理 (1)油脂：称取2~3g液体油脂(脂确至0.01 g)， 置于10 mL具塞离心管中，加入3mL甲醇，漩涡混匀1~2min(使甲醇和油脂充分混匀)，放置2 min， 以3 000 r/ min离心5 min， 吸取上清液，置于10 mL容量瓶中，重复提取3次，合并提取液，用甲醇定容至10 mL、摇匀。经0.45Hm 滤膜过滤，供液相色谱测定用。 (2)油炸食品：根据油脂含量的多少称取50~300g(精确至0.01g)食品置于500 mL 具塞锥形瓶中，混合均匀，加入适量的石油醚浸泡试样，放置过夜，用快速滤纸过滤后，减压蒸馏回收残留脂肪，取其中2~3g(精确至0.01g)油脂，按照1.3.2(1)进行操作。 2 结果与讨论 经波长扫描， PG、TBHQ、BHA和BHT的最大吸收波长分别为274，291，290，278nm。为兼顾4种组分同时具有较大的吸收值，选择280 nm 作为检测波长。 2.2 流动相的选择 试验表明，采用等度的甲醇-水(V：V= 92： 8)做流动相，并不能将4种抗氧化剂有效分离(图1)，采用有梯度的甲醇-水作流动相虽可同时分离4种组分，但PG的峰形拖尾，使用为体积分数为1%的乙酸水溶液作为流动相，峰形有所改善，而且4种组分可很好分离(图2)。这是由于流动相中加入了乙酸后，有利于抗氧化剂的稳定，因此改善了出峰效果。 2.3 提取试剂的选择 本试验分别采用甲醇、乙腈和乙醇作为提取溶剂对同一样品进行试验，提取方法均采用漩涡混匀液液萃取提取1次，结果见表2。由表2可知，甲醇、乙醇和乙腈均可将4种组分提取，但乙醇提取出的非极性物质可能相对较多，而乙腈毒性高且价格相对昂贵，因此选择甲醇作为提取溶剂。 图1 等度洗脱色谱图 Figure 1Chro magraphy of isocratic elution 图2 梯度洗脱色谱图 Figure 2Chromagraphy of solv ent programming elut ion 表2不同溶剂提取效果比较 Table 2Comparison of ext racting resultsof different solvents /(gkg) 提取溶剂 PG TBHQ BHA BHT 甲醇 0.098 0.16 0.074 0.052 乙腈 0.089 0.14 0.066 0.037 乙醇 0.089 0.15 0.065 0.059 2.4 提取次数的选择 在常温下，以甲醇为提取剂考察提取次数对提取效果的影响，见图3.由图3可知，提取1次，可将PG 和TBHQ基本提取完全，提取3 次，BHA和BHT提取量基本完全。因此，提取3次可同时测定这4种抗氧化剂。 图3 不同提取次数的提取效率 Figure 3 Efficiency of various extracting times 2.5 线性关系和方法检出限 将1mg/mL的混合标准溶液稀释成0.0002~0.1mg/mL标准使用液，取20HL 进样分析，以标准溶液的浓度为横坐标，检测所得峰面积为纵坐标建立回归方程，结果表明， PG 在该浓度范围内的线性关系良好，TBHQ、BHA、BHT在0.0005~0.1mg/mL范围内线性关系良好，回归方程及相关系数见表3。以信号为仪器噪音3倍时所对应的检出浓度为仪器的检出限3，PG的检出限为0.000 2 mg/mL，TBHQ、BHA、BHT的检出限均为0.000 6mg/mL。取样量为2.00g时，该方法对样品中 PG 的检出限为 0.001 g/kg，TBHQ、BHA、BHT的检出限均为0.003 g/kg。而中国标准2对PG的允许添加量不超过 0.1 g/kg， TBHQ、BHA、BHT 的允许添加量不超过 0.2 g/kg，因此，此检出限能满足监控这4种抗氧化剂添加量的要求。 表3 标准曲线的线性方程及相关系数 Table 3 Linear equations and corelat ioncoefficiences of standard curves 抗氧化剂 线性方程 相关系数R2 PG Y=5.96×107X-228 0.999 9 ＴBHQ Y=1.69×10X+369 0.9999 BHA Y=1.68×107X-661 0.9999 BHT Y=11.00×10X- 343 0.999 8 2.6 回收率与精密度 选用不含4种待测组分的液体植物油，进行3水平添加回收试验，每个添加水平取5个平行样，方法的回收率与精密度数据见表4。由表4可知，该方法回收率高，实验精密度好，可用于油脂及油炸食品中这4种抗氧化剂的同时测定。 表4 回收率与精密度实验结果 Table 4 Results of precision and recovery test of samples (n= 5) 添加水平/ PG TBHQ BHA BHT (g"kg-1) 回收率/% RSD/% 回收率/% RSD/% 回收率/% RSD/ % 回收率/% RSD/% 0.050 97.5 4.30 97.8 3.80 91.5 3.20 84.2 4.02 0.100 98.2 3.82 99.2 4.20 92.5 2.84 85.4 4.42 0.200 98.3 3.86 98.9 2.85 90.8 4.50 85.5 4.82 平均值 98.0 3.99 98.6 3.62 91.6 3.51 85.0 4.42 2.7 样品测定 监督抽查的一些企业产品及参加国家认监委能力验证试验的样品(比对样品)的测定结果见表5和图4~8。 表5一些企业产品的检测结果 Table 5 Results of some company productsdetermination /(gkg ) 样品 PG TBHQ BHA BHT 大豆油01 未检出 未检出 未检出 未检出 菜籽油02 未检出 0.0682 未检出 未检出 调和油03 未检出 0.0482 未检出 未检出 菜籽油04 未检出 0.126 未检出 未出 调和油 05 未检出 未检出 未检出 未检出 花生油06 未检出 未检出 未检出 未检出 调和油07 未检出 未检出 未检出 未检出 菜籽油08 0.00502 0.0982 未检出 未检出 猪油09 未检出 0.0482 未检出 未检出 大豆油10 未检出 0.126 未检出 未检出 调和油11 未检出 未检出 未检出 未检出 葵花籽油12 未检出 未检出 未检出 未检出 花生油13 未检出 0.038 2 未检出 未检出 菜籽调和油14 未检出 0.130 未检出 未检出 国家比对样15 未检出 未检出 0.108 0.065 调和油16 未检出 未检出 未检出 未检出 油炸玉米17 未检出 未检出 未检出 未检出 油炸薯片18 未检出 未检出 未检出 未检出 结果表明，在这4种抗氧化剂中，目前企业主要使用的抗氧化剂是 T BHQ，实验室间比对结果为“满意”，可见本方法的准确性。 图4 不含抗氧化剂的植物油色谱图 Figure 4HPLC chomatogram of oilcontaining no antioxidant 图5 不含抗氧化剂的油炸薯片色谱图 Figure 5 HPLC chomatogram of containing no antioxidant 图6 含TBHQ的植物油色谱图 Figure 6 HPLC chomatogram of oil containing TBHQ 图7含PG 和TBHQ的植物油色谱图 Figure7 HPLC chomatogram of oilcontaining PG and TBHQ 图8 实验室间比对样品的色谱图(含BHA、BHT) Figure 8HPLC chromato gram of comparative sample bet-ween different labs(containing BHA and BHT) 3 结论 本试验用甲醇做溶剂采用液液萃取法实现了油脂及油炸食品中4种常用抗氧化剂的有效快速提取，利用HPLC 采用梯度洗脱实现了这四种抗氧剂的分离和同时检测。 ( 参考文献 ) ( 郑诗超，张锐利，汪学荣，等.天然抗氧化剂在油脂中的应用研究 [J].食品与机械，2003，19(5)：7~8. ) ( 2 王 茂启， 王 竹天，陈君石，等.GB 2760——2007食品添加剂使用 卫生标准[S].北京：中国标准出版社，2007. ) ( 3 国家食品卫生监督检测所.食品卫生检验方法法理部分[M].北京：中国标准出版社，2003. ) ( 4 余晔，刘军，舒永兰. HPLC 法测定花生酱中BHA、BHT、TBHQ [J].食品科技，2005(12)：67~ 6 9. ) ( 5 卢业举，顾亮，刘坤，等. GB/T 5009.21927——2008食品中叔丁 基对苯二酚的测定-高效液相色谱法[S].北京：中国标准出版 社，2008. ) ( 6 游飞明翁其香.气相色谱法快速测定油脂及加工食品中的 BHA、BHT、TBHQ[J] . 福建分析测试，2005，14(4)：2290~ 2292. ) ( 7 李桂凤，郝征红，董淑敏.高效液相色谱法测定食品中抗氧化剂 BHA， BHT，PG[J].色谱，1998，16(3)：276~27 7 . ) ( 8 李兴根，韩芷玲.气相色谱法测定食品中的酚类抗氧化剂[J].粮 油食品科技，14(5)：55~5 6 . ) ( 9 胡小钟，余建新，孙国宝，等.用高效液相色谱法同时测定油脂中 的9种抗氧化剂[J].分析测试学报，1999，18(5)：21~ 24. ) ( 10 胡小钟，余建新，钱浩民，等.油脂中九种抗氧化剂的反相高效液相色谱法分离和测定[J].分析科学学报，2000，16(1)：23~26. ) ( 11 岳振峰，谢丽琪，吉彩霓.油脂及制品中BHA BHT PG TBHQ 快速测定方法研究[J].食品与发酵工业，2002，28(10)：49~52. ) 成分，并在其后用注明“nano”(纳米技术)。 味料对共同批准程序。 该草案涉及的新型食品是指1997年5月前未在欧盟市场 大量消费的食品，既包括一些运用新生产工艺如纳米技术 (译自：泰晤士报) ◎China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http：//www.cnki.ne