牛奶中黄曲霉毒素检测方案

CHIMA DATRYINDUSTRY 测定方 牛奶及奶粉中黄曲霉毒素M的快速测定 张鹏'， 张艺兵'，王晶”，王雄 (1.青岛出入境检验检疫局，山东青岛266002；2.家标准物质研究中心，北京100013；3.北京中维康技求有限公司，北京100044) 摘 要：采用免疫亲和柱——荧光光度法快速测定了牛乳及乳制品中黄山山喜素M。试样经离心、脱、过滤后，滤液经过键合有黄白霉喜素M.特殊抗体的免疫亲和杜净化，此抗依对黄山霉毒素Mi具有专一的识别能力，黄壳M键合在分柱中的抗依上。用甲与水之比为10：90 的混合液液免疫亲和柱上杂质除去；以平醇与水之比为80：26的混合液通过分离柱洗脱；加入涣溶液衍生，以捉高测定定敏度。衍生化后的洗脱液于荧光光度计中测定询霉毒素Mi，检测低限为0.1pg/ kg；在0.1-1.0jig/kg范国内，回收为89.6%-96.1%，支系数为D.52%~5.8%，分析一个样品的时间小于30 min，分析过程中不使用黄山喜素M标准物质。果求明，本方法具有准确、简单、快、安全等优点，可以满足少量和批量样品的检测需要。 关键词：品；黄毒M；快速控测 中图分类号： TS252.7 文献标识码： A 文堂编号：1001-2230(2002)06-0030-03 Rapid detecting aflatoxin M in milk and milk powder ZHANG Peng'， ZHANG Yi-bing'， WANG Jing， WANG Xiong， (1.Qingdao Entry-Exit Inspection and Quaratine Burcau， Qingduo 266002， China； (2. National Research Center for Ccrlificd Refcrence Muterials， Beijing 1000t3， China；3. Beijing Clover Technology Co. Ltd.，Beijing 100044，China) AUstract：：AAlletoxin Mi in milk and milk powder are extracted and sepnratcd by iminunouflinity column. Then the columas inwahed with metnol weler (10：90) twicc and the conccntated allatoxin Mi arc cluted with meltutiol water (90：10). Te allalox-in M. is delerined by lluorineler with hmmine. Test portions and spiked a1 0.1， 0.5，1.0pg kg， necoveries are 89.6%~96.1%， vuriuble coeffeicnt are 0.52%~5.8%， the lowesl. It is 30 minutes for ntulysis one soiaple. Key words： milk powder； rupit detecting aflaloxin Mi； aflatoxin M； immunoalBnity coluian 为23%的情况下，制备出一种优质的膨化营养小吃。 3 结束语 挤压蒸煮加工技术符合人们对食品加工的需要。作为本世纪食品科学与工程领域的重要新技术之一，对挤压蒸煮技术的加工设备和工艺进行全面深人的研究开发具有重要意义。随着对挤蒸煮加工机理研究的不断深人以及新设备的开发，挤压煮技术必将广泛地应用于乳制品工业中。 ( 参考文献： ) ( |1] 刘灭印，陈存社.挤压膨化食品生产工艺与与方[M].北京：中 国轻工出版社，199 9 .122-125，163-164. ) ( |2)金世琳.乳与乳制品生产[M].北京：中国轻工出版社， ) ( 1977.42B-440. ) ( [ 3 ] QUEGUINEJt C，E L IANE D， CAVALIER-SALOU C， et al . A p plicationsof c xtrusion cooking In dairy pn x licts： pr e purution of f ut ami l ogies bymicrocoagulation of wltey proleins[J]. 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Fo a r Extntsian Scienceand Teclutology.1992，387-414. ) 0 引 言 黄山毒索M足动物摄人黄曲霍素B后在体内经羟基化代谢的产物，该产物一部分从尿和乳汁排出，，一部分存在于动物的可食部分(如乳、肝、蛋类、特、血和肌肉中)。其中以乳最为常见，目乳和乳制品中的黄山霉素M在生产和藏期间相对稳定，不被巴氏消游破坏。用含有黄山霉素B：100pg/ kg的饲料喂牛，牛乳中含有黄山霉素M约为1 g/ kg。 M：的凿性和致性与黄山山毒索Bi的本相似。山于华乳及其制品是人类(特别是婴儿)的主要食品，因此各国对其限量的要求十分严格。我国及许多国家规定牛奶及奶制品中曲每紫M：的含量不得超过0.5 ug/ kg；飞欧盟的规定更加严格，为0.05 pg!kg。测定黄曲符索M：的方法为薄层色谱法、高效液相色谱法、酶联免疫吸附测定法法1-4、质谱法、放射免疫测定法。这些方法都具有如下不足之处：①在操作过程中，需要使用的黄曲霉素M：作为标定标准物，对操作人员造成较大的沾污危险，而且黄曲微毒崇M标准物质购买十分困难；②操作过程烦琐、复杂、时间长，劳动强度大；③仪器设备昂贵、笨重、操作复杂，难以实现现场快速分析；④灵敏度较差，重复性很难得到满意结果。本文采用免疫亲和一荧光光度法快速测定了牛乳及乳制品中黄素Mi。 1 测定原理 试样经过离心、脱脂、过滤后，滤液经过键合有赏曲游素M特殊抗休的免疫亲和柱净化，此抗体对黄曲霉素M具有专一的识别能力，黄素M键合在分离柱中的抗体上。用甲醇与水之比为I0：90 的混合液将免疫宗和柱上杂质除去；以中醇与水之比为80：20的混合液通过分离柱洗脱，加人澳溶液衍生，以提高测定灵敏度。衍生化后的洗脱液于爽光光度计中测定黄山索M。 2 仪器设备与试剂 4系列真菌毒专用荧光光度计(进口)； 心机(相对加速离心力大于2000g)； 空气压力泵： 玻璃试试(12mm×75 mm，无荧光特性)； 玻璃纤维滤纸(直径11cm， 孔径1.5pm)； 黄曲M 免疫亲和(进口)； 甲醇(CHOH)为液相色谱级纯； 氯化钠 (NaCl) 为分析纯： 溴储备液(0.01%)：称取适量溴溶于水，配成质量分数0.01%的储备液，避光保存。溴水使 用液(0.002%)：取10mL质量分数为0.01%的澳溶液加人40 mL水混勾，于棕色瓶中保存备用(现用现配). 荧光光度叶标定溶液(进口)：红色标定管(内含0.006 80g二水硫酸至宁，2mL浓度为 0.05 mol/L硫酸溶液，此溶液相当于2ng/g黄山毒索M：标准液)；货标定标(内含0.003 40g二水硫酸宁，2mL 浓度为0.05 mol/L硫酸溶液，此溶液相当于1ng/g黄山素M标准溶液)；绿色标定管(内含2mL浓度为 0.05 mol/L 硫酸溶液，此溶液不含黄曲M)。 3 分析步骤 (1)样品提取 a.液术牛乳及牛乳制品：取50mL液体样品，加人1.0g氯化钠，在离心机上以2000g离心10 min，仔细地将用于牛奶分析的有效部分(低层)移取，不要扰动顶部脂肪层，将脱脂的牛奶以玻璃纤维滤纸过滤。 1.固体奶粉及奶制品：称取5g样品，用50 mL30~60℃热纯水溶解混匀，加人1.0g氯化钠，在离心机上以2000g心10 min， 小心仔细地将用于牛奶分析的有效部分(低层)移取，不要扰动顶部脂肪层，将脱脂的牛奶以玻璃纤维滤纸过滤。 (2)净化 将免疫亲和柱连接于10mL玻璃针简下。准确移取10.0 mL上述澄清滤液注入玻璃筒中，将空气压力泵与针连接，调节压力便溶液以约6mL/min 流速缓慢通过免疫亲和柱，直至2~3mL空气通过体。以 10 mL甲醇与水之比为10：90 混混合液清洗桂子2次，子去全部流出液，并使2-3mL空气通过柱体。准确加人1.0mL醇与水之比为80：20的混合液洗脱，流速为1-2mL/min， 收集洗脱液于玻璃试管中，供检测用。 (3)测定 荧光光度校校：在激发波长360 mm，发射波长450mm条件下，以绿色标定管调节荧光光度计的荧光强度值读数为0.0；以红色标定管调节荧光光度计的荧光强度值读数为2.0；以黄色标定管验证荧光光度计的荧光强度值读数应该为1.0±0.2。 样液测定：取上述洗脱液加人1.0mL质量分数为0.002%澳溶液，于荧光光度计中测定黄山霉毒素M含量。 (4)结果计算 荧光光度计测定结果按下式讨算 式中：X为试样中黄曲行毒素Mi含，(pg/kg)；c为荧光光度计中读取的样液中黄山海素M：的浓度 (ng/mL)；V为样液最终定容体积(mL)； m 为最终样液所代表的试样量(g)。 1 测定结果 在50mL定容样品中添加黄曲毒素M：添加农度水平为0，0.1，0.5， 1.0pg/kg， 然后按照上述分析步骤进行测定，果如表1-2所示。 表1牛奶测定结果 ug/kg 样品编号 添加张水平/( 05 0. 03110 0249 0.97 0 0.088 0.47 092 0. 0.092 0.48 0.92 03 0.097 0.46 0.96 6 0 0089 051 0.91 0 0-100： 0.40. 096 0 0-097 0.48 0.93 平均 0 0096 0247 0..94 平均回收泳 0 96.15. 94.0% ：93.9% GV变异系数 0.759 3.55 2496 表2 奶粉测定结果 pg/kg 品厚 pg/kg 铃加泄水平/(ugk 0 91 5 10 3 0 0089 0.41 0.95 0 0.098 0.45 0.91 0 02092 0：46 0，83 10 0-10 0.1G 0.81 0 0.091 053 0.95： 0 0086 0.41 0.94 0 0.097 048. 0.88 平 0 0.093 0.16 0.90 平均回收率 11005 93.3% 91.49 89.60 C，变系数 0.32% 4.165 589 结 论 采用免疫亲和住——荧光光度法检测牛乳及乳0品中的黄曲待涉素M，检测低限为0. 1pg/kg，三0.1~1.0 pg/kg范照内，回收率为89.6%5.1%，变异系数为0.52%-5.8%，分析一个样品7时间小于30 min， 分析过程中不使用黄曲得素标准物质。本方法具有准确、简单、快速、安全特点，可以满足少量和批量样品的检测需要。 ( 卡考文献： ) ( ]中华人民共和国国家标准(GB/T 5009.24-1996)，食品中黄 索B与M的定方法[SI. ) ( [2]亚雄，正品译.用免疫亲和层析法净化、高效液和色谱法测定牛奶和奶粉中中山行素M的含[J].检验检疫科学，2002，12 (2)：58-61， ) ( [3]林维，李继业，田苗，单克隆免疫亲和一高效液相色法测定牛乳中黄霍毒素M[J].中国乳品工业，2000，28(6)：24- 26. ) ( [41怕品，刘滨，刘兴介，等.联免疫吸附法抢测黄曲素M； 的研究[J].中华预防医学杂志，1993，27(4)；233-235. ) 作者简介：张(1964一)男，工程师，从事食品中真的毒穿的分析方法研究。 诚聘英才 n 国家乳业工程技术研究中心因科研业务工作需要，面向全社会招聘研究所所长1名。专业要求生物工程、食品加工、畜牧或其他乳与乳制品相关技术领域，博士以上学历，男性，年龄45周岁以下。应聘者应从事专业技术性工作5年以上，并有较好的语言、文字表达能力。本职位工作待遇从优，有意者欢迎面谈。 联系人：张潇宇 联系电话：0451-6680677 13904611266P e 联系地址：哈尔滨市南岗区学府路337号 邮 编：150086 第第期(总第) ——Yul.No. al