迪马科技助力2024年国抽：GB 5009.298-2023三氯蔗糖的测定

2024国抽项目：食品中三氯蔗糖的测定2024年食品安全监督抽检实施细则中要求对酱油、食醋、酿造酱、葡萄酒等14种食品进行三氯蔗糖测定，其中冷冻饮品、其他蒸馏酒检验项目中，三氯蔗糖作为2024年新增项目。检测方法中均选定GB 22255-2014、GB 5009.298-2023两个食品安全国家检测标准，并要求2024年3月6日之前使用GB 22255-2014检测，2024年3月6日（含）之后使用GB 5009.298-2023检测，或根据检验日期选择现行有效的检测方法进行检测。《GB 5009.298-2023 食品安全国家标准 食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的测定》于2023年9月6日发布，2024年3月6日实施，替代《GB 22255-2014食品安全国家标准 食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的测定》。新标准与老标准相比，第一法高效液相色谱法调整了样品分类、称样量范围、检出限和定量限，仍然保留了75%甲醇水提取浓缩、液液萃取等复杂的前处理过程；增加了第二法"高效液相色谱-串联质谱法"。迪马科技多年来一直关注食品中三氯蔗糖测定的相关问题，并提供完整的解决方案。之前发布过三氯蔗糖解决方案，参考标准《GB 22255-2014》重现了国标方法，详细解决方案可去迪马科技查询：食品中三氯蔗糖的测定——HPLC法解决方案。参考即将实施的标准《GB 5009.298-2023食品安全国家标准 食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的测定》重现了国标方法，并对酱油、醋、甜面酱等容易产生杂质干扰的样品，以及高含量样品，进行前处理方法优化。优化方案中乙酸铅作为沉淀剂，纯水提取，可避免标准中提取为75%甲醇水溶液浓缩时间长、液液萃取等复杂过程，简化了前处理流程，提高了样品检测效率。两种检测方法如下：第一法：高效液相色谱法：采用ProElut® PLS 200mg/6mL(Cat.#:68012)净化，Bio-Bond® C18 250×4.6mm，5μm(Cat.#:84006)色谱柱分离，蒸发光散射检测器检测。第二法：高效液相色谱-串联质谱法：液相色谱-串联质谱法采用ProElut® PLS 200mg/6mL(Cat.#:68012)净化，Leapsil® C18 100x4.6mm，2.7μm(Cat.#:86002)色谱柱分离测定，以下为部分实验结果，供广大客户参考。第一法：高效液相色谱法一、国标重现实验 GB 5009.298-20231、适用范围本方案适用于红酒、棒棒糖、蜜饯、绿豆糕、酱油、醋和甜面酱中三氯蔗糖的检测，红酒方法定量限20mg/kg，棒棒糖、蜜饯、绿豆糕、酱油、醋和甜面酱方法定量限30mg/kg。2、提取2.1 液态酒类试样（红酒）2g样品，旋蒸至干，用1mL水溶解，经0.45μm亲水PTFE滤膜过滤后，待测。2.2 糖果、蜜饯试样（棒棒糖、半边梅）2g样品，加入5mL水，振荡3min，加入15mL甲醇，0.5mL乙酸锌和0.5mL亚铁qinghuajia溶液，继续振荡30s，经60℃水浴加热15min，超声提取20min，3000rpm离心10min，将上清液移入50mL离心管中，沉淀物加入5.0mL甲醇水（75+25），振荡30s，3000rpm离心10min，重复提取2次，合并上清液。将全部上清液转移至分液漏斗中，加入30mL正己烷，振摇2min，静置分层20min，取下层液体在50℃下减压蒸至1mL左右，用9mL水分3次冲洗旋蒸瓶，冲洗液合并至15mL离心管中，超声处理5min，3000rpm离心10min，待净化。2.3 醋、酱油、酱及酱制品类试样（酱油、醋、甜面酱）2g样品，加入1.0g中性氧化铝，加入5mL水，振荡3min，加入15mL甲醇，继续振荡30s，超声提取20min，3000rpm离心10min，将上清液移入50mL离心管中，沉淀物加入5.0mL甲醇水（75+25），振荡30s，3000rpm离心10min，重复提取2次，合并上清液。将全部上清液转移至分液漏斗中，加入30mL正己烷，振摇2min，静置分层20min，取下层液体在50℃下减压蒸至1mL左右，用9mL水分3次冲洗旋蒸瓶，冲洗液合并至15mL离心管中，超声处理5min，3000rpm离心10min，待净化。2.4 其他试样（绿豆糕）2g样品，加入5mL水，振荡3min，加入15mL甲醇，0.5mL乙酸锌和0.5mL亚铁qinghuajia溶液，继续振荡30s，超声提取20min，3000rpm离心10min，将上清液移入50mL离心管中，沉淀物加入5.0mL甲醇水（75+25），振荡30s，3000rpm离心10min，重复提取2次，合并上清液。将全部上清液转移至分液漏斗中，加入30mL正己烷，振摇2min，静置分层20min，取下层液体在50℃下减压蒸至1mL左右，用9mL水分3次冲洗旋蒸瓶，冲洗液合并至15mL离心管中，超声处理5min，3000rpm离心10min，待净化。3、标准品配制标准储备溶液：准确称取标准品，用水配制成10mg/mL的储备液，吸取一定体积10mg/mL储备液用水配成浓度为1000μg/mL的储备液。4、净化ProElut® PLS 200mg/6mL（Cat.#:68012）(1)活化：依次向柱中加入4mL甲醇、4mL水，弃去流出液；(2)上样：将待净化液加入柱中，弃去流出液（控制流速不超过每秒1滴）；(3)淋洗：柱上液面为2mm左右时加入1mL水；(4)洗脱：3mL甲醇洗脱;(5)定容：将洗脱液在50℃下减压蒸干，用乙腈水（11+89）定容至1mL，疏水PTFE滤膜过滤，供HPLC分析。5、色谱条件色谱柱：Bio-Bond® C18 250×4.6mm，5μm（Cat.#:84006）流速：1.0mL/min进样量：20μL柱温：35℃检测器：ELSD温度：40℃压力：4.0barGain：4流动相：A：水；B：乙腈，A:B=89:11。当检测样品基质复杂，强保留物质影响后续检测时，可采取梯度洗脱程序，梯度设置如下：6、添加回收结果及色谱图7、小结参考即将实施的标准《GB5009.298-2023食品安全国家标准 食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的测定》，重现了国标方法，除酱油样品，回收率均在80%-120%之间，酱油样品回收率为78.8%，偏低；第一法5.2.2 醋、酱油、酱及酱制品类试样基线不平，低浓度不便于定量。二、方法优化实验 GB 5009.298-20231、适用范围本方案适用于酱油、醋、甜面酱中三氯蔗糖的检测，方法定量限30mg/kg。(针对国标方法重现GB 5009.298-2023第一法5.2.2 醋、酱油、酱及酱制品类试样在目标峰出峰位置附近杂质干扰、基线不平，低浓度不便于定量的问题，对前处理方法进行了优化和简化。）2、提取2g样品，加入8mL 水和2mL 200g/L乙酸铅溶液，振荡2min，超声提取5min，6000rpm离心5min，取10mL上清液，待净化。3、标准品配制标准储备溶液：准确称取标准品，用水配制成10mg/mL的储备液，吸取一定体积10mg/mL储备液用水配成浓度为1000μg/mL的储备液。4、净化ProElut® PLS 200mg/6mL（Cat.#:68012）(1)活化：依次向柱中加入5mL甲醇、5mL水，弃去流出液；(2)上样：将待净化液加入柱中，弃去流出液（控制流速不超过每秒1滴）；(3)淋洗：向柱中加入5mL 20%甲醇水溶液，弃去流出液；(4)洗脱：向柱中加入3mL甲醇，收集流出液；(5)定容：将洗脱液在50℃下减压蒸干，用流动相定容至1mL，疏水PTFE滤膜过滤，供HPLC分析。5、色谱条件色谱柱：Bio-Bond® C18 250×4.6mm，5μm（Cat.#:84006）流速：1.0mL/min进样量：20μL柱温：35℃检测器：ELSD温度：40℃压力：4.0barGain：4流动相：A:水；B:乙腈，A:B=89:11。当检测样品基质复杂，强保留物质影响后续检测时，可采取梯度洗脱程序，梯度设置如下：6、添加回收结果及色谱图7、小结对前处理方法进行了优化和简化后，相比于GB 5009.298-2023第一法，酱油样品和甜面酱样品基线更平、目标峰附近无杂质干扰，便于定量，但高水平加标酱油样品，回收率偏低。三、酱油样品优化实验 GB 5009.298-20231、适用范围本方案适用于酱油中三氯蔗糖的检测，方法定量限30mg/kg。(针对已优化方法中酱油的高水平加标回收率低的问题，对前处理过程再次进行优化，并把添加水平提高到2000mg/kg。）2、提取分别称取0.25g、0.5g、1g、2g样品，加入8mL 水和2mL 200g/L乙酸铅溶液，振荡2min，超声提取5min，6000rpm离心5min，取10mL上清液，待净化。3、标准品配制标准储备溶液：准确称取标准品，用水配制成10mg/mL的储备液，吸取一定体积10mg/mL储备液用水配成浓度为1000μg/mL的储备液。4、净化ProElut® PLS 200mg/6mL（Cat.#:68012）ProElut® PLS 500mg/6mL（Cat.#:68005）(1)活化：依次向柱中加入5mL甲醇、5mL水，弃去流出液；(2)上样：将待净化液加入柱中，弃去流出液（控制流速不超过每秒1滴）；(3)淋洗：向柱中加入5mL 20%甲醇水溶液，弃去流出液；(4)洗脱：向柱中加入3mL甲醇，收集流出液；(5)定容：将洗脱液在50℃下减压蒸干，用流动相定容至1mL，疏水PTFE滤膜过滤，供HPLC分析。5、色谱条件色谱柱：Bio-Bond® C18 250×4.6mm，5μm（Cat.#:84006）流速：1.0mL/min进样量：20μL柱温：35℃检测器：ELSD温度：40℃压力：4.0barGain：4流动相：A：水；B：乙腈，A:B=89:11。当检测样品基质复杂，强保留物质影响后续检测时，可采取梯度洗脱程序，梯度设置如下：6、添加回收结果及色谱图7、小结加标水平为2000mg/kg 酱油样品中，PLS小柱填料质量由200mg提高到500mg后，优化后方法的回收率由71.5%提高到82.2%；样品称样量由2g降低到0.25g，优化后方法的回收率由71.5%提高到100.7%。总结1. 食品安全国家标准GB5009.298-2023第一法重现的结果中，前处理方法5.2.2 醋、酱油、酱及酱制品类试样在目标峰位置出现基线不平不便于定量的问题，使用优化方法后，酱油和甜面酱样品在三氯蔗糖目标峰附近基线更平，无杂质干扰，便于定量，并简化了流程提高了实验效率。2. 加标水平为2000mg/kg 酱油样品中，PLS小柱填料质量由200mg 提高到500mg后，优化后方法的回收率由71.5%提高到82.2%；样品称样量由2g降低到0.25g，优化后方法的回收率由71.5%提高到107.7%，由此可见，增加填料质量或者降低称样量可以提高回收率，客户可根据对回收率的要求，进行选择。3. 蒸发光散射检测器作为质量型检测器，响应值与溶质颗粒大小和数量有关，根据标准要求，以标准系列工作液质量浓度为横坐标，以峰面积响应值为纵坐标，绘制对数回归曲线，并测试线性范围。本次实验标准曲线取20、50、200、500、1000μg/mL，相关系数R= 0.9979365；当加入5000μg/mL时，R= 0.9940418，客户可根据自身对曲线相关系数的要求选择是否加入浓度为1000μg/mL以上浓度的标准品。第二法：高效液相色谱-串联质谱法国标重现实验 GB 5009.298-20231、适用范围本方案适用白酒、红酒、糖果、酱油、醋、甜面酱、饼干中三氯蔗糖的检测。2、标准品配制(1) 三氯蔗糖储备液：称取蔗糖标准品0.25g，用水溶解并定容至25mL，配置成浓度为10.0mg/mL的储备液。(2) 三氯蔗糖标准工作液：准确吸取适量三氯蔗糖储备液，用水稀释并定容，配置成浓度为100μg/mL的工作液。3、提取3.1 白酒样品称取混匀后的白酒2g至10mL容量瓶，用水定容至刻度线，试样过Nylon膜（Cat.#:37177），上机分析。3.2 红酒样品称取混匀后的红酒2g于蒸发皿中，60℃水浴上加热30min，用10mL水分3次冲洗蒸发皿的残渣，冲洗液全部转移至25mL容量瓶中，用水定容至刻度并摇匀，待净化。3.3 糖果样品称取2g样品于50mL离心管中，加入10mL水，涡旋振荡3min，加入1mL乙酸锌溶液、1mL亚铁qinghuajia溶液，经60℃水浴加热15min，水浴过程中注意摇散。超声提取20min，8500r/min离心5min，取上清于25mL容量瓶中，10mL水重复提取1次，合并提取液，加水定容至刻度，混匀后转移至50mL离心管中，加入15mL正己烷，涡旋振荡3min，8500r/min离心5min，弃去上层正己烷，下层清液待净化。3.4 饼干、酱油、醋称取2g样品于50mL离心管中，加入10mL水，涡旋振荡3min，加入1mL乙酸锌溶液、1mL亚铁qinghuajia溶液，超声提取20min，8500r/min离心5min，取上清于25mL容量瓶中，10mL水重复提取1次，合并提取液，加水定容至刻度，混匀后转移至50mL离心管中，加入15mL正己烷，涡旋振荡3min，8500r/min离心5min，弃去上层正己烷，下层清液待净化。乙酸锌溶液：称取21.9g乙酸锌，加3mL乙酸，加水溶解至100mL。亚铁qinghuajia溶液：称取10.6g亚铁qinghuajia,加水溶解至100mL。4、净化ProElut® PLS 200mg/6mL（Cat.#:68012）(1)活化：用4mL甲醇、4mL水活化；(2)上样：准确移取10mL试样提取液过柱，控制流速不超过1滴/s，弃去流出液，推干小柱；(3)洗脱：加入3mL甲醇洗脱，并收集洗脱液到10mL容量瓶中，加水定容，混匀，过Nylon膜（Cat.#:37177），上机分析。5、色谱条件(1) UPLC条件色谱柱：Leapsil® C18 100x4.6mm, 2.7μm （Cat.#:86002)流速：0.6mL/min进样量：1μL柱温：40℃流动相：A: 水  B:甲醇梯度设置：(2) 质谱条件电离模式：ESI扫描方式：负离子扫描检测方式：多反应监测电喷雾电压：-4500V雾化气压力：50psi辅助气压力：50psi气帘气压力：20psi离子源温度：500℃6、添加回收结果及色谱图相关产品信息