【系列二】IPHASE/汇智和源 体外药代动力学研究热点问题解答

体外药代动力学研究—热点问题—第一题    原形药的剩余量接近100%，还需要进行CYP酶的代谢表型研究吗？怎么做？体外代谢速率低，确实意味着体内的代谢速率也很可能低，也可以不做，但同时需要注意的是体内代谢速率低，不代表代谢比例就一定低(比如在排泄速率更低的情况下)，故仍需要尽可能搞清楚药物通过CYP酶代谢的具体亚型途径。除非有证据表明CYP酶并不是主要的代谢途径；技术上，如果原药的剩余量接近100%，确实不可能通过原药的代谢比率来进行判断，但可以通过代谢产物的生成量来判断，这种情况下，最好是有合成出来的主要的代谢产物，如果没有目标代谢产物的对照品，也可以采用代谢物鉴定中所找到的主要代谢产物离子对来进行粗略的定性检测。第二题    什么情况下需要考虑进行UGT表型研究？在有证据（体外或体内数据）表明UGT是主要代谢酶的情况下需要考虑进行UGT表型研究。UGT表型研究只采用重组酶法来进行，因为目前学术界并无工人的UGT亚型特异性抑制剂可采用。但需要注意的是，CYP和UGT甚至包括其他的代谢酶，都可能同时是主要的代谢途径。第三题    CYP450酶表型研究中，是否一定需要采用化学抑制法和重组酶法两种方法进行实验？代谢酶表型研究是定性研究，目前的法规和行业观点都认为单一方法无法得出足够可靠的结论，需化学抑制法和重组酶法两种方法结合起来做结论。但一般也认为，结论中以化学抑制法的结果为主，重组酶法的结果为辅。第四题    CYP450酶表型研究中，化学抑制法和重组酶法结果不一致时该如何解释？首先，这种情况不应该叫不一致，因为这是两个不同的系统代谢后的结果，这两种代谢系统出现的任何差异都不应该叫不一致，而是代谢系统自身的差异导致的正常现象；其次，肝微粒体是直接提取的肝脏的组分，是一种同源的代谢系统，而重组酶是通过蛋白表达系统表达出来的，是一种非同源的测试系统，所以结论中以化学抑制法的结果为主，重组酶法的结果为辅。第五题    为什么CYP3A需要用两个结构不同的探针底物进行酶抑制的评估？CYP3A是体内最重要的药物代谢酶，经由其产生的DDI的代谢风险最高。不同结构的药物可能结合到CYP3A蛋白不同的位点而发生代谢，且可能结合至不同位点而产生酶抑制作用。故CYP3A需要用两个结构不同的探针底物进行酶抑制的评估。第六题    酶抑制研究中什么时候测定Ki值？当IC50＜1 μM时，强烈推荐进行Ki值测定；当IC50为1~10 μM之间，较为接近有效浓度时，也可以考虑测定Ki值。第七题    是否需要评估化合物是否为时间依赖性抑制剂？TDI是一种比可逆抑制带来更严重的副作用的状况，初步推荐单点法或2点法评估，高点可以为50×Cmax或剂量/250mL的0.1倍，一旦发现，则必须精确评估。第八题    酶抑制实验中，底物的消耗量为什么要小于20%？通常情况下，酶抑制实验我们会检测产物的生成量，会尽量选择相对高的底物浓度，且保证选择的孵育时间点是在线性反应时间点内。如果底物浓度过低，有可能会很快达到平衡，从而导致结果判定有误或难以判断。第九题    酶抑制研究中，是否可以用Cocktail探针底物法？文献和资料中提到，IND申报需要使用单底物法进行酶抑制研究，筛选型研究可以使用cocktail探针法。第十题    筛选阶段酶抑制实验可以不设置平行吗？建议实验中设置平行，如果平行做不好，可能试验系统存在问题。设置平行可确保组内精密度、准确度得到有效控制，也是实验结果有效性的直接证据。十一题    酶诱导的受试物浓度一般设置多少？如果体系待测物溶解度很差有没有什么解决办法？酶诱导实验需要设置3个不同的浓度，浓度水平需涵盖预期人体内有效血药浓度，最高浓度的选择至少比平均的人体内的有效血药浓度高一个数量级。如果在水相中溶解度很差，可以选择有机溶剂进行溶解，如DMSO，但是需要控制有机溶剂在体系中加入量。十二题    在酶诱导实验中是否需要在酶活性和mRNA两个水平上进行评估？通常需要结合酶活性和mRNA两个水平上的结果做结论，且mRNA水平更能真实反映诱导源头上的效应，且更为敏感。仅测量酶活性主要存在问题是：当同时存在抑制作用时，可能会掩盖诱导作用，而通过测量mRNA水平进行转录分析可解决该问题。且应通过阳性对照验证系统，证明其中所有主要的CYP酶有功能且可被诱导。十三题    为什么酶诱导实验初始时只需要测试三个酶亚型？CYP诱导的产生源自药物对核受体的激活从而使相应的mRNA表达量增高，而主要的CYP亚型只涉及到三种核受体。其中，CYP3A、CYP2C的核受体是PXR，CYP1A2的核受体是AhR，CYP2B6的核受体是CAR，而CYP2D6则未发现可被诱导。如果CYP3A被诱导，则需要检测CYP2C。十四题    在诱导实验中为什么要连续加药诱导？一般情况下促变药应多次给药直至其达到稳态后，再评价其对底物药物的影响。若促变药并非诱导剂或者时间依赖型抑制剂，并且可证明单次与多次给药对酶/转运体的影响相似时，可采用单次给药进行 DDI 研究。十五题    肝细胞代谢实验中阳参药物的代谢较参考数据慢很多，可以考虑哪些原因？可能会有多种原因会导致该结果。首先，需要确认实验过程是否有问题，不同厂家的产品在使用上会存在或多或少的差异，我们需参照产品COA确认自己的实验结果和厂家提供的数据是否匹配。其次，确认肝细胞的质量是否达标，质量不好会直接影响实验结果。肝细胞质量可以从复苏存活率、维持状态等多个方面进行考察。十六题    请问本公司是否可承接原代肝细胞相关项目？本公司有专业的技术人员和完善的分析检测平台，可承接原代肝细胞相关项目，如果感兴趣可与我们商务人员对接。体外药代动力学研究热点问题——系列二 Q：原形药的剩余量接近100%， 还需要进行 CYP 酶的代谢表型研究吗?怎么做?A：体外代谢速率低，确实意味着体内的代谢速率也很可能低，也可以不做，但同时需要注 意的是体内代谢速率低，不代表代谢比例就一定低(比如在排泄速率更低的情况下)，故仍需 要尽可能搞清楚药物通过 CYP 酶代谢的具体亚型途径。除非有证据表明 CYP 酶并不是主 要的代谢途径；技术上，如果原药的剩余量接近 100%，确实不可能通过原药的代谢比率来 进行判断，但可以通过代谢产物的生成量来判断，这种情况下，最好是有合成出来的主要的 代谢产物，如果没有目标代谢产物的对照品，也可以采用代谢物鉴定中所找到的主要代谢产 物离子对来进行粗略的定性检测。 Q：什么情况下需要考虑进行 UGT表型研究? A：在有证据(体外或体内数据)表明 UGT 是主要代谢酶的情况下需要考虑进行 UGT 表型 研究。UGT 表型研究只采用重组酶法来进行，因为目前学术界并无工人的 UGT亚型特异性 抑制剂可采用。但需要注意的是， CYP 和 UGT甚至包括其他的代谢酶，都可能同时是主要 的代谢途径。 Q： CYP450 酶表型研究中，是否一定需要采用化学抑制法和重组酶法两种方法进行实验?A：代谢酶表型研究是定性研究，目前的法规和行业观点都认为单一方法无法得出足够可靠 的结论，需化学抑制法和重组酶法两种方法结合起来做结论。但一般也认为，结论中以化学 抑制法的结果为主，重组酶法的结果为辅。 Q： CYP450 酶表型研究中，化学抑制法和重组酶法结果不一致时该如何解释? A：首先，这种情况不应该叫不一致，因为这是两个不同的系统代谢后的结果，这两种代谢 系统出现的任何差异都不应该叫不一致，而是代谢系统自身的差异导致的正常现象；其次，肝微粒体是直接提取的肝脏的组分，是一种同源的代谢系统，而重组酶是通过蛋白表达系统 表达出来的，是一种非同源的测试系统，所以结论中以化学抑制法的结果为主，重组酶法的 结果为辅。 Q：为什么 CYP3A需要用两个结构不同的探针底物进行酶抑制的评估? A： CYP3A 是体内最重要的药物代谢酶，经由其产生的 DDI 的代谢风险最高。不同结构的 药物可能结合到 CYP3A 蛋白不同的位点而发生代谢，且可能结合至不同位点而产生酶抑制 作用。故 CYP3A 需要用两个结构不同的探针底物进行酶抑制的评估。 Q：酶抑制研究中什么时候测定 Ki 值? A： 当IC50<1 pM时，强烈推荐进行Ki值测定；当IC50为1~10 uM之间，较为接近有 效浓度时，也可以考虑测定 Ki 值。 Q：是否需要评估化合物是否为时间依赖性抑制剂? A： TDI是一种比可逆抑制带来更严重的副作用的状况，初步推荐单点法或2点法评估，高 点可以为 50xCmax 或剂量/250mL 的0.1倍，一旦发现，则必须精确评估。 Q：酶抑制实验中，底物的消耗量为什么要小于20%? A：通常情况下，酶抑制实验我们会检测产物的生成量，会尽量选择相对高的底物浓度，且 保证选择的孵育时间点是在线性反应时间点内。如果底物浓度过低，有可能会很快达到平衡，从而导致结果判定有误或难以判断。 Q：酶抑制研究中，是否可以用 Cocktail 探针底物法? A：文献和资料中提到， IND 申报需要使用单底物法进行酶抑制研究的，筛选型研究可以使用 cocktail 探针法。 Q：筛选阶段酶抑制实验可以不设置平行吗? A：建议实验中设置平行，如果平行做不好，可能试验系统问题存在。设置平行可确保组内 精密度、准确度得到有效控制，也是实验结果有效性的直接证据。 Q：酶诱导的受试物浓度一般设置多少?如果体系待测物溶解度很差有没有什么解决办法?A： 酶诱导实验需要设置3个不同的浓度，浓度水平需涵盖预期人体内有效血药浓度，最高 浓度的选择至少比平均的人体内的有效血药浓度高一个数量级。如果在水相中溶解度很差，可以选择有机溶剂作为其溶剂，如 DMSO， 但是需要控制有机溶剂在体系中加入量。 Q：在酶诱导实验中是否需要在酶活性和mRNA 两个水平上进行评估? A：通常需要结合酶活性和 mRNA两个水平上的结果做结论，且 mRNA 水平更能真实反映诱 导源头上的效应，且更为敏感。仅测量酶活性主要存在问题是：当同时存在抑制作用时，可 能会掩盖诱导作用，而通过测量 mRNA 水平进行转录分析可解决该问题。且应通过阳性对 照验证系统，证明其中所有主要的 CYP酶有功能且可被诱导。 Q：为什么酶诱导实验初始时只需要测试三个酶亚型? A： CYP 诱导的产生源自药物对核受体的激活从而使相应的 mRNA 表达量增高，而主要的 CYP 亚型只涉及到三种核受体。其中， CYP3A、CYP2C 的核受体是 PXR， CYP1A2 的核 受体是 AhR， CYP2B6 的核受体是 CAR， 而 CYP2D6贝未发现可被诱导。如果 CYP3A 被 诱导，则需要检测 CYP2C。 Q：在诱导实验中为什么要连续加药诱导? A：一般情况下促变药应多次给药直至其达到稳态后，再评价其对底物药物的影响。若促变 药并非诱导剂或者时间依赖型抑制剂，并且可证明单次与多次给药对酶/转运体的影响相似 时，可采用单次给药进行 DDI 研究。 Q：肝细胞代谢实验中阳参药物的代谢较参考数据慢很多，，可以考虑哪些原因?A：可能会有多种原因会导致该结果。首先，需要确认实验过程是否存在问题，不同厂家的 产品在使用上会存在或多或少的差异，我们需参照产品 COA 确认自己的实验结果和厂家提 供的数据是否存在差异。其次，确认肝细胞的质量是否达标，质量不好会直接影响实验结果。质量的确认可以从复苏存活率、维持状态等多个方面进行考察。 Q：请问本公司是否可承接原代肝细胞相关项目? A：本公司有专业的技术人员和完善的分析检测平台，可承接原代肝细胞相关项目，如果感 兴趣可与我们商务人员对接。