【应用案例】超分辨率荧光成像揭示Trop2对非小细胞肺癌和正常细胞膜的变化

跨膜糖蛋白Trop2与许多上皮癌有关。它不仅在促进胎儿肺生长方面发挥作用，还参与肿瘤发生、恶性转化和肿瘤播散。然而，Trop2在分子水平上的详细分布仍然未知。本文使用直接随机光学重建显微镜揭示了Trop2在培养和原代肺癌细胞和正常细胞膜上的空间组织。所有类型的癌细胞都比正常细胞呈现更多的Trop2定位。通过SR-Teseller聚类分析，我们发现Trop2以簇的形式存在于所有膜上;然而，癌细胞产生的簇比正常细胞更多，由更多的分子组成。本研究结果揭示了膜Trop2的异质分布，突出了肺癌细胞与正常细胞之间膜Trop2聚集特征的显著差异，为进一步研究Trop2聚集在肺癌中的机制和功能奠定了基础。研究结果（节选）1.Trop2在不同培养细胞上的高分辨率成像NSCLC主要包含三种类型，每种类型中选择一种细胞作为代表：A549代表ADC，sk-MES-1代表SqCC，H460代表LCC。由于NSCLC是异质性原发性支气管上皮肿瘤，我们选择HBE细胞作为对照组。TIRF图像显示Trop2散射在所有细胞膜上，其中一些形成荧光斑点，但无法清晰区分（图1a-d）。然而，重建的dSTORM图像显著提高了分辨率（图1e-h）。我们观察到HBE细胞膜上只有少数Trop2，而在三种类型的NSCLC细胞膜上则有大量Trop2。此外，放大后的图片详细显示了Trop2的异质分布（图1i-l）。图 1.Trop2在不同细胞系上的dSTORM成像四种细胞膜上Trop2的TIRF图像：（a）HBE，（b）A549，（c）H460和（d）SK-MES-1。（e–h）在这四个细胞膜上相应的重建的Trop2的dSTORM图像。（i-l）白色框框显示的 Trop2 dSTORM 图像的放大视图。比例尺：5 μm（e–h） 和 1 μm（i–l）2.通过SR-Tesseler方法对Trop2进行聚类分析除了获得Trop2的高分辨率图像外，使用合适的方法来定量分析蛋白质的空间分布同样重要。到目前为止，各种分析方法已被应用于超分辨率成像数据，例如Ripley's K函数，DBSCAN （基于密度的噪声空间聚类分析），H-SET [36]（分层单发射器假设检验）和FOCAL （用于定位的快速优化聚类算法）。每种算法都有自己的优势和应用范围。在这里，我们使用了一种新的图形处理方法SR-Tesseler，它可以精确地分割定位并提取集群的信息。图 2. SR-Tesseler分析示意图（a）在HBE细胞膜上重建的Trop2的dSTORM图像。细胞膜用红线圈出“ROI”。（b） 闪烁校正后的 dSTORM 图像。（c） 由许多多边形组成的沃罗诺伊图。（d） 对每个多边形的局部化密度进行阈值化提取的蓝色区域（e） 提取的簇（绿色）的定位密度高于对象的平均密度。（f-h） 图（c–e）框在中的多边形、对象和聚类的放大图像。比例尺：4 μm（a–e） 和 300 nm（f–h）。3.Trop2 在原发性肺癌细胞上的显着簇分布为了进一步探索和验证Trop2簇在原代细胞上的分布特征，我们选择人原发性肺腺癌细胞作为NSCLC的代表，配对原代正常肺上皮细胞作为对照。与培养细胞一致，dSTORM图像显示Trop2过度表达并在肺癌细胞上形成大簇，而在正常肺细胞上存在相对较少的蛋白质和小簇（图3a-f）。统计数据表明，Trop2在癌细胞上的定位密度几乎是正常细胞的两倍（图3g）。SR-Tesseler分析还证明了聚类特征的显著差异。癌细胞上的簇面积和簇数都远大于正常细胞上的簇面积和簇数（图3h-i）。此外，癌细胞具有更密集的簇，由200多个定位组成，而对于不超过100个定位的小簇，正常细胞占更大的比例（图3j）。结果与从A549和HBE细胞获得的结果一致。这些发现证实了Trop2与肺癌的肿瘤发生有关，其过表达和聚集分布可能使其成为肺癌诊断的良好标志物。图 3.原发性肺腺癌细胞和正常细胞上的 Trop2 分布通过 dSTORM 成像显示（甲至乙）（a）原发性肺癌细胞和（b）正常肺细胞上的Trop2的TIRF图像。（c–d）同一细胞膜上的相应dSTORM图像。（e–f）图（c–d）白色框框的 dSTORM 图像的放大视图。比例尺：5 μm（c–d） 和 1 μm（e–f）。（g）Trop2在这两种细胞上的定位密度。（h） 不同细胞膜上的团簇标准化。（i） 每平方微米的团簇数（j） 团簇百分比。所有结果均来自五个独立实验中的十个细胞样品。采用双尾不配对t检验处理统计学意义。*P < 0.05，**P < 0.01，****P < 0.0001，ns 表示不显著。结论综上所述，利用dSTORM观察了Trop2在NSCLC细胞和正常细胞（培养细胞和原代细胞）膜上的分布格局，并利用SR-Tesseler分析了其聚集特征。我们发现Trop2在癌细胞上的表达和聚集水平高于正常细胞，这表明Trop2在癌细胞中的过表达和聚集的共同特征，这将有助于早期癌症诊断。尽管Trop2簇存在于所有肺癌细胞中，但值得注意的是，不同种类的癌细胞之间的团簇性质不同。例如，A549和H460细胞具有相对更多的簇，而SK-MES-1细胞具有与HBE细胞相似的簇数。我们的研究结果为癌症相关蛋白（如Trop2）聚集的分子机制提供了新的见解，并有利于开发针对癌症中Trop2的新药。文献等详见【阅读原文】↓↓↓在本研究中，研究者主要借助STORM超分辨率显微镜来研究Trop2对非小细胞肺癌和正常细胞膜的变化，目前在国内，随机光学重建显微镜STORM已成功实现商用，有需要STORM成像技术进行实验研究的专家老师们，请文末填写问卷，即可预约获得 iSTORM 超高分辨率显微成像系统试拍服务~力显智能现已发布的超高分辨率显微成像系统 iSTORM，成功实现了光学显微镜对衍射极限的突破，使得在20纳米的分辨率尺度上从事生物大分子的单分子定位与计数、亚细胞及大分子复合物结构解析、生物大分子生物动力学等的研究成为现实，从而给生命科学、医学等领域带来重大突破。