超分辨率荧光显微成像技术在活细胞成像中的应用

STORM实现超分辨是基于对每个荧光团的定位，因此这种技术也被称为单分子定位显微（single molecule localization microscopy， SMLM）。然而，受荧光探针和成像过程特点的限制，STORM在活细胞成像中的应用仍然面临巨大的挑战。STORM实现超分辨的第一个关键要素是光开关荧光探针。以商用染料Alexa Fluor 647为例，传统STORM实验中通常会将其耦联在抗体蛋白上，通过免疫荧光标记的方法标记到待识别的细胞结构上，细胞需要先固定并不适合活细胞成像。要想实现STORM在活细胞成像中的应用，首要任务是从亮度、对比度以及光稳定性等方面筛选或开发适合活细胞标记和成像的光开关探针。主要有两种方式：（1）采用蛋白质标签的方式实现光开光荧光分子在特定目标蛋白质上的特异性标记，（2）膜染料的应用，这类探针大多是现有的商业探针，具有一定的光开关性质，且可以直接标记于活细胞质膜和细胞器膜。1.采用蛋白质标签的STORM活细胞成像2010年，Wombacher等将ATTO655和甲氧苄啶标签（trimethoprim tag，TMP-tag）耦联在一起，对活HeLa细胞核中的H2B蛋白进行标记，实现了20 nm分辨率的活细胞STORM成像，成功观察到细胞核内的核蛋白复合物中有H2B的存在，而这种细节结构利用衍射受限的技术是观察不到的（图1a）。2013年，Lukinavicius等将SNAP标签和近红外荧光团硅罗丹明SiR耦联在一起，标记到活U2OS细胞核中的H2B蛋白上用于STORM活细胞成像，观察到了H2B蛋白在细胞核中的分布（图1b）.随后他们还进一步验证了SiR-SNAP的特性，证明它是STORM活细胞实验的优良探针。图1 蛋白标签用于活细胞核H2B蛋白的STORM成像（a）TMP标签耦联ATTO655；（b）SNAP标签耦联SiR。2.基于膜探针的STORM活细胞成像2012年，Shim等利用STORM实现了对活细胞中细胞器膜的超分辨成像，空间分辨率达到20~60 nm，已接近EM的分辨率水平.在该工作中，他们通过大量的实验，筛选出了适合对各种细胞器膜进行活细胞标记和STORM成像的膜探针，最终采用DiI标记细胞膜、MitoTracker Red标记线粒体膜、ER-Tracker Red标记内质网膜、LysoTracker Red标记溶酶体膜（图4a~d）。图2 膜探针用于活细胞膜结构的STORM成像（a）Dil标记质膜；（b）MitoTracker Red标记线粒体；（c）ER-Tracker Red标记内质网；（d）LysoTracker Red标记溶酶体。在本研究中，研究者主要借助STORM超分辨率显微镜来研究活细胞成像，目前在国内，随机光学重建显微镜STORM已成功实现商用，有需要STORM成像技术进行实验研究的专家老师们，请文末填写问卷，即可预约获得 iSTORM 超高分辨率显微成像系统试拍服务~力显智能现已发布的超高分辨率显微成像系统 iSTORM，成功实现了光学显微镜对衍射极限的突破，使得在20纳米的分辨率尺度上从事生物大分子的单分子定位与计数、亚细胞及大分子复合物结构解析、生物大分子生物动力学等的研究成为现实，从而给生命科学、医学等领域带来重大突破。参考文献References