中物 5-乙酰水杨酸甲酯 (MAS)、对羟基苯甲酸丁酯(BP)、 磺胺二甲氧嘧啶和奈法唑酮均购自 Sigma- Aldrich检测方案(二手分析仪器)

质谱仪中，分辨能力和动态范围与 质量精度之间不存在直接关系。例 如，当进行合成化合物的结构确证 时，分辨能力达到 200,000 以上的 傅立叶变换（FT）质谱仪，其质量 精度一般仅比分辨率为 10,000 的 飞行时间（TOF）质谱仪高出 2 倍。 对于 Agilent TOF 和 Q-TOF，当分 析纯化合物时，分辨率提高 2～3 倍，其质量精度并没有表现出明显 改善。然而，当分析复杂的混合物 时，结果却截然不同。本文通过研 究证明，复杂混合物分析中当化合 物的子离子质量数非常接近时（分 离度<50 mDa），TOF 和 Q-TOF 分 辨率和动态范围的提高将如何对质 量精度产生影响。分辨率对复杂样品精确质量分析的影响 ● 应用报告 Doug MclntyrePat PerkinsEdgar Nagele 摘要 本应用报告证明： · Agilent 6520 精确质量四极杆-飞行时间(Q-TOF)液质联用仪(LC/MS)和 Agilent 6220 精确质量飞行时间(TOF)液质联用仪的性能 · Agilent 6520 精确质量 Q-TOF LC/MS 和 Agilent 6220 精确质量 TOFLC/MS 的动态范围和质量分辨率都得到了提高 ·这两种系统在质量分析和分子量计算方面具有很高的准确性 ·仪器性能的提高对样品检测结果的影响 引言 质谱仪中，分辨能力和动态范围与质量精度之间不存在直接关系。例如，当进行合成化合物的结构确证时，分辨能力达到200，000以上的傅立叶变换(FT)质谱仪，其质量精度一般仅比分辨率为 10，000 的飞行时间(TOF)质谱仪高出2倍。对于 Agilent TOF 和Q-TOF， 当分析纯化合物时，分辨率提高2~3倍，其质量精度并没有表现出明显改善。然而，当分析复杂的混合物时，结果却截然不同。本文通过研究证明，复杂混合物分析中当化合物的子离子质量数非常接近时(分离度<50 mDa)， TOF 和Q-TOF分辨率和动态范围的提高将如何对质量精度产生影响。 实验部分 仪器 Agilent 1200 系列快速高分离度分离液相色谱系统包括： ( ·Agilent 1200 系列 SL型二元泵和脱气机 ) ·Agilent 1200 系列SL 型高效自动进样器(ALS SL)，带恒温装置·Agilent 1200 系列柱温箱(TCC) ( ·Agilent 1200 系列 SL型二极管 阵列检测器(DAD SL) ) ( ·Agilent 6220 精确质量 TOFLC/MS 或 Agilent 6520 精确质量 Q-TOF LC/MS ) ( ·色谱柱1： Agilent ZORBAX SB-C18， 2.1x30 mm，粒径3.5um ) ( ·色谱柱2： Agilent ZORBAX SB-C18， 2.1x 150 mm，粒径1.8 um ) 样品 待测化合物5-乙酰水杨酸甲酯(MAS)、对羟基苯甲酸丁酯(BP)、磺胺二甲氧嘧啶和奈法唑酮均购自Sigma- Aldrich，以甲醇溶解并制成浓度为1mg/mL 的贮备液。1 mg/mL 的司坦唑醇甲醇溶液购自Alltech。所有溶液加水稀释至浓度为 10-30 ng/uL。制备了一系列奈法唑酮的稀释液，浓度范围为2 ng/mL 到 100 ug/mL。(进样量为1uL。)化合物结构见图1。 LC TOF 条件 ( HPLC分析条件： ) ·溶剂A：含0.1%甲酸的水溶液 ·溶剂B：含0.1%甲酸的甲醇溶液 ·流速：0.5mL/min， 90%B 等度洗脱 1min ( ·柱温：45C ) Agilent 6220 精确质量TOFLC/MS 数据采集参数如下： ·离子源：电喷雾 (ESI) 正离子模式，双喷雾器带参比标样校正 ·干燥气：10L/min， 300°C ·雾化器压力：45 psi ·质量范围：100~1000 ·扫描速率：3次/sec ·碰撞诱导解离电压：125V ·截取锥：60V ·毛细管电压：4000V ( ·仪器状态：1700 m/z，1、2、 4 GHz ) LC Q-TOF 条件 液相色谱仪运行条件如下： ·溶剂A：含0.1%甲酸的水溶液 ·溶剂B：含0.1%甲酸的乙腈溶液·流速：0.5mL/min ·梯度1：使用色谱柱1，柱温45°C，4分钟内溶剂B的比例由20%升至60%(该色谱条件用于司坦唑醇实验) ·梯度2：使用色谱柱2，柱温60°C，15分钟内溶剂B的比例由5%升至75%(该色谱条件用于鉴定奈法唑酮代谢产物) Agilent 6520 精确质量Q-TOFLC/MS 的采集参数如下： ·离子源：电喷雾((ESI)正离子模式，双喷雾器带参比标样校正 ·干燥气：10L/min， 300°C ·雾化器压力：45 psi ·质量范围：80~1000(MS 和MS/MS) ·扫描速率：3次/秒 ·碰撞诱导解离电压：200V ·截取锥：60V ·毛细管电压：4000 V ·碰撞能量：35V(磺胺二甲氧嘧啶)或55V(司坦唑醇) ·在设定的 MS/MS 模式下运行时，分离宽度设为中(4m/z) ·仪器状态：1700 m/z，1、2、4 GHz 结果与讨论 仪器分辨率 ( TOF 质谱仪所表现的分辨率与以下因素都有关：质量分析器的实际分 辨能力；检测器电路对信号的响 应；以所需的速度检测输出信号的能力。与早期数字化输出速率 1 GHz 的型号相比，Agilent 6220 精确质量 TOF LC/MS 和 Agilent6520 精确质 量 Q-TOF LC/MS 均使 用反应更快的放大电路，并且检测器的数字化输出速率可以分别达到 1、2或4GHz。这种新的信号处理方式已有介绍。[1] ) 这类质量分析器在数字化输出速率为 4 GHz 时， m/z 118的分辨率通常能达到 10，000以上， m/z 1522 的分辨率能达到20000以上。数字化输出速率对测得的分辨率的影响见表1。 从表中可以明显看出，数字化输出速率为1 GHz时，在低 m/z处数据的采样过疏，导致分辨率远远低于仪器能力。1 GHz 的采样速率相当于每1纳秒采样1次，因此，对于m/z 118处峰宽为1纳秒的色谱峰，采样次数为1。事实上，1 GHz 时，测得的 m/z 118的分辨率约为4000。 当分析纯化合物时，数字化速率由1 GHz 变为4 GHz 分辨率可提高2~3倍，但却不能明显改善质量精度。通常，对于分子量范围为100~800之间的化合物，质量精度为1~2 ppm。在测定质量误差在10 ppm 以上的样品时，显然有其他化合物中表面上看来质量数相等的 m/z 到达时间 (nsec) AM(mDa) At (nsec) 1 GHz 下全 FWHM的样品数 4 GHz 下全 FWHM 的样品数 118 20，000 12 1 1 4 1522 69.211 76 1.7 1.7 6.8 表1 对于列举的m/z值，质量差、时间差以及样品数均为数模转换器(ADC)采样速率的函数。FWHM 为质谱峰半峰高处的峰宽 离子影响了检测。因此，分辨率的提高将改善复杂样品的质量分析精度，从而可以从MS 和 MS/MS数据中获得正确的分子式。 TOF 模式下的分辨率和精度 通过试验，比较了 TOF 模式下分别以1 GHz 和4 GHz 进行数字化时的质量误差。MAS 与 BP的分子量相差36 mDa。将两种化合物以128：1~1：1的各个比例混合，调流动相比例，使这两种化合物在色谱中不能得到分离。在1 GHz下，计算每个样品的质量误差，见表2。 稀释液 质量误差 (ppm) 128：1 2.89 64：1 3.25 32：1 5.09 16：1 10.13 17.13 33.17 64.06 120.51 表2 数字化速率为 1 GHz 时， MAS 的质量误差是MAS/BP比值的函数 在4 GHz， 所观测的[M+H]+离子完全分离，两个化合物的质量精度均小于1ppm，应用Agilent分子式生成器分析这两种离子，所得分子式完全正确。另外，在一个很窄的m/z 范围内提取离子色谱图，发现这两种化合物的洗脱时间仅相差0.5秒。结果见图2和图3。 仪器动态范围 采集质谱图时，另一个重要的因素是质谱仪的动态范围，包括扫描间动态范围和扫描内动态范围。如果动态范围较宽，潜在的低丰度化合物在其他高丰度基质成分的存在下也能检出。 图2 使用 Agilent 6520 精确质量Q-TOFLC/MS 对一系列浓度的奈法唑酮进行检测，作为扫描间动态范围的一个例子[2]。检测浓度从检测限(柱上2 pg)到检测器饱和浓度(柱上100 ng)(图4)。对于所有浓度水平，检测得到的质量偏差都很低，小于2 ppm， 均通过计算得到了分子式。 在4 GHz 下采集得到的 MAS 和 BP提取离子色谱图(EICs) 图3 数字化速率为 4 GHz时， MAS 和BP的[M+H]+离子，给出了分辨率和质量误差 作为扫描内动态范围的一个例子，在浓度为 10 ng/uL的烟酰胺存在的情况下，对浓度为 500 fg/uL 的红霉素进行检测(图5)。结果明确表明扫描内动态范围达到4.36个数量级，而且准确测定了两种化合物的质量，质量精度小于1ppm。 图4 Q-TOF测定奈法唑酮的动态范围，证明了在 4.5个数量级内质量偏差小于2 ppm。奈法唑酮分子式[M+H]+=C，H33N，0，CI， 测得质量 m/z=470.2317。使用梯度2进行色谱分离。 图5 在高达5个数量级的扫描内动态范围进行精确质量分析 MS/MS模式下的分辨率和质量精度 Agilent 6520 精确质量Q-TOFLC/MS 能给出质量精度在5 ppm以内的 MS/MS 数据。这在鉴定杂质和代谢物结构方面非常有用[2]。当对表面上质量相等而分子式不同的碎片离子进行区分时，分辨率就显得非常重要。磺胺二甲氧嘧啶和司坦唑醇能产生这样的碎片离子。 与许多磺胺类药物一样，在进行MS/MS分析时，磺胺二甲氧嘧啶产生 m/z 156 的碎片离子。当以Agilent 6520 精确质量Q-TOFLC/MS 测定时，对该 m/x 156的碎片进行仔细分析，发现实际有两个相差 65.4 mDa 的不同碎片离子。即使以1 GHz 的数字化速率，也足以将这两种碎片离子分开，因此可以测量这两种碎片离子的精确质量。图6显示了在1、2、4 GHz 下采集 的 m/z 156离子的 MS/MS 放大图。 司坦唑醇裂解产生一系列离子对(如 m/z 95， 119， 135，147，161)，这些离子对之间的质量数仅差25mDa(图7)。由于差异极为微小，要采用4 GHz 的数字化速率才能测得足够准确的质量值。图8显示了碎片离子m/z 95 的测定结果。在 4 GHz下，分辨率一般为15，000左右。应用安捷伦分子式生成器对该条件下采集到的 MS/MS 质谱图进行分析，得到的分子式如表3所示。这些分子式合理性很高，因为它们的绝对质量偏差很小，通常小于1mDa， 而且与母离子是相符的。 图6 对于 m/z 156 的磺胺二甲氧嘧啶裂解产物，质量偏差是数字化速率的函数 图7司坦唑醇裂解产生的m/z 95(红色)和m/z161(蓝色)碎片离子 结论 本文表明： ·当分析质量数相同的杂质时，TOF 质谱仪分辨能力的提高，能够改善质量精度 ·动态范围的提高，有助于对扫描间和一次扫描内高、低丰度的化合物进行准确的质量数检测 ·MS/MS 数据分辨率的提高，能够增强获取准确质量数和分子式信息的信心，从而更易于实现结构鉴定 ( 参考文献 ) 1. ( Hidalgo， A. J . ， Fjeldsted， J. C. and Frazer， W.， “The Application ofHigh Speed Oscilloscope Analog- to-Digital Converters to Time-of-Flight Mass Spectrometry， ” Proceedings 54th ASMSConference， MPE 076， 2007. ) 2. ( Nagele， E.， "Improvingperformance， data and resultsthrough expanded dynamic rangeand higher mass resolution，"Agilent Technologies ApplicationNote， publication number 5989- 8528EN，2008. ) 图8 司坦唑醇m/z值为95的碎片离子 实测值 计算 偏差 偏差 分子式 丢失质量 丢失分子式 丰度 m/z m/z (mDA) (ppm) 95.06151 95.06037 -1.13 -11.93 C5H7N2 234.19837 C16260 3495 95.08624 95.08553 -0.72 -7.53 234.17321 C14H22N20 3337 119.06040 119.06037 -0.02 -0.18 rHNC-H-N2 210.19837 C14260 357 119.08578 119.08553 -0.26 -2.15 CgH11 210.17321 C12H22N20 1990 135.09166 135.09167 0.02 0.11 CgH11N2 194.16707 C13H220 628 135.11642 135.11683 0.41 3.05 C10H15 194.14191 C11H18N20 389 147.09201 147.09167 -0.33 -2.28 CgH11N2 182.16707 C12H220 376 147.11785 147.11683 -1.02 -6.96 C11H15 182.14191 C10H18N20 161.10823 161.10732 -0.90 -5.60 C10H13N2 168.15142 C11H200 161.13242 161.13248 0.05 0.32 C2H17 168.12626 CgH16N20 表3 从司坦唑醇m/z值分别为95，119，135， 147， 161的碎片离子推导得到的分子式 Doug McIntyre 和 Pat Perkins 是 安捷伦科技公司在美国的应用化学 家， Edgar Nagele 是安捷伦科技 公司德国的应用化学家 www.agilent.com/chem/ms：cn ◎安捷伦科技公司，2008 2008年1月中国印刷5989-9215CHCN Agilent Technologies Agilent Technologies