小麦粉中呕吐毒素检测方案

小麦粉中呕吐毒素检测的的固相萃取方法 （Copure® 230多功能净化柱） 呕吐毒素也叫做脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (deoxynivalenol, DON) ，其是一种单端孢霉烯族化合物，由于该毒素能够引起动物呕吐等中毒症状， 故而称为呕吐毒素。小麦作为主食作物，是呕吐毒素分布最广的作物之一。在小麦生产加工的过程中， 呕吐毒素伴随着面粉的制成存在于小麦粉中，严重危及人们的身体健康。因此精准快速地检测粮食作物及其制成品中呕吐毒素含量，对于保证食品安全具有重要的意义。 逗点生物采用最新自主研发的Copure®230多功能净化柱，建立小麦粉中呕吐毒素检测的LC和LC-MS/MS两种检测方法。LC方法中两个水平（200 ng/g，400 ng/g）的加标回收率均在90-120 %之间，RSD小于10 %；LC-MS/MS方法中两个水平（40 ng/g，60 ng/g）的加标回收率均在90-110 %之间，RSD小于10 %。本方法操作简便快捷，与国内外的竞品相比，具有回收率高和除杂效果好的优势，能够作为小麦粉中呕吐毒素检测的参考方法。 参照 《GB 5009.111-2016 食品安全国家标准 食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定 》。 样品前处理 1.1 样品提取 （1）称取2 g样品，再加入20 mL乙腈-水溶液（9+1）混合均匀。 （2）涡旋15 min后，6000 r/min离心5 min，取上清液，待净化用。 1.2 样品净化 （1）向玻璃试管中加入10 mL样品提取液。 （2）将净化柱橡胶头从试管顶端插入试管中，并向下压净化柱至试管底端。 （3）将净化柱上部净化后的样品提取液取出至样品瓶或EP管中。 （4）取5 mL净化提取液，40℃下氮气吹干，用1 mL初始流动相复溶，涡旋 30s 溶解残渣，过0.22 μm微孔滤膜，上机分析。 仪器条件 LC方法 仪器设备：UltiMate 3000（Thermo Fisher Scientific），配DAD检测器 色谱柱：Agilent ZORBAX C18 (4.6 mm×250 mm，5 μm) 流动相： A：甲醇 B：去离子水 流动相梯度： 表1 流动相洗脱程序 时间 A（%） B（%） 0.00 20 80 2.00 20 80 10.00 70 30 12.00 70 30 13.50 20 80 16.00 20 80 流速：0.8 mL/min 柱温：35℃ 进样体积：50.0 L 检测波长：218 nm LC-MS/MS方法 仪器设备：液相色谱-串联质谱联用仪 SCIEX Triple Quad™ 4500 色谱柱： C18 ， 1.9 um， 2.1x100mm 流动相： A：水 B：甲醇 流动相梯度：初始95%A（0 min~1 min），95%~5%A（1.1 min~3 min）， 5%A（3.1 min~3.5min），95%A（3.51min~6.0min）。 流速：0.3 mL/min 柱温：室温 进样体积：4.0 L 离子源模式：ESI- 检测方式：多离子反应检测（MRM） 采集条件： 表2 离子选择参数 化合物名称 母离子（m/z） 子离子（m/z） CE (V) DP (V) DON 295.1 265.1* -15.0 -15.0 138.2 -26.0 -12.0 3A-DON 337.0 307.1* -16.0 -12.0 173.0 -15.0 -12.0 15A-DON 337.0 150.0* -25.0 -12.0 219.1 -16.0 -12.0 13C-DON 310.1 261.0 -16.0 -12.0 279.1* -16.0 -12.0 13C-3-ADON 354.0 323.0* -16.0 -12.0 230.0 -20.0 -13.0 注：*为定量离子。 三、实验结果 LC方法 图1 不同品牌多功能净化柱处理加标样品后的色谱图（①小麦粉样品-未净化处理 ②Copure®230-净化处理 ③ 国内B品牌-净化处理 ④ 国外A品牌-净化处理） 从图1中可知，经过Copure®230净化处理后，上机液中杂质被明显吸附，色谱图中杂峰更少，目标峰旁边无干扰峰，定量更准确；Copure®230的杂质去除效果明显优于国内B品牌，与国外A品牌相近，回收率在90-120%之间，满足实验使用需求。 表3 LC方法加标回收实验结果 检测项目 加标 水平 （ng/g） Copure®230 国外A品牌 国内B品牌 回收率R/% RSD/% 回收率R/% RSD/% 回收率R/% RSD/% 呕吐毒素 200 115 1.74 85.1 3.95 145 1.60 400 101 7.39 116 8.78 146 9.54 图2 使用Copure®230净化后的加标样品的色谱图（200 ng/g） LC-MS/MS方法 表4 LC-MS/MS方法加标回收实验结果 检测项目 加标 水平 （ng/g） Copure®230 国外A品牌 国内B品牌 回收率R/% RSD/% 回收率R/% RSD/% 回收率R/% RSD/% DON 40 102 3.59 99.5 1.67 103 5.19 60 95.9 3.39 99.2 1.51 97.5 2.05 3A-DON 40 97.1 3.10 95.8 3.66 97.5 4.10 60 106 3.46 101 7.61 100 3.32 15A-DON 40 91.2 1.64 94.0 1.06 93.2 2.14 60 106 0.63 102 3.60 1.08 2.77 从图3中可知，经过Copure®230净化处理后，TIC图中杂质被明显吸附，色谱图中杂峰更少，DON、3A-DON、15A-DON三种目标物回收率在95~110%之间，符合实验要求，整体性能与国外竞品相当。 图3 不同品牌多功能净化柱处理加标样品后的TIC色谱图（①小麦粉样品-未净化处理 ②Copure®230-净化处理 ③ 国外A品牌-净化处理 ④ 国内B品牌-净化处理） 订购信息 产品信息 名称 应用描述 规格 COAF226 Copure® 226多功能净化柱 玉米赤霉烯酮，黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2 25支/盒 COAF228 Copure® 228多功能净化柱 展青霉素，黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2 25支/盒 COAF224 Copure® 224多功能净化柱 玉米赤霉烯酮 25支/盒 COAF223 Copure® 223多功能净化柱 黄曲霉毒素M1、M2 25支/盒 COAF229 Copure® 229多功能净化柱 赭曲霉毒素 25支/盒 COAF230 Copure® 230多功能净化柱 呕吐毒素 25支/盒 ④ ③ ② ① ② ④ ③ ① 呕吐毒素也叫做脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (deoxynivalenol, DON) ，其是一种单端孢霉烯族化合物，由于该毒素能够引起动物呕吐等中毒症状， 故而称为呕吐毒素。小麦作为主食作物，是呕吐毒素分布最广的作物之一。在小麦生产加工的过程中，呕吐毒素伴随着面粉的制成存在于小麦粉中，严重危及人们的身体健康。因此精 准快速地检测粮食作物及其制成品中呕吐毒素含量，对于保证食品安全具有重要的意义。逗点生物采用最 新自主研发的Copure®230多功能净化柱，建立小麦粉中呕吐毒素检测的LC和LC-MS/MS两种检测方法。LC方法中两个水平（200 ng/g，400 ng/g）的加标回收率均在90-120 %之间，RSD小于10 %；LC-MS/MS方法中两个水平（40 ng/g，60 ng/g）的加标回收率均在90-110 %之间，RSD小于10 %。本方法操作简便快捷，与国内外的竞品相比，具有回收率高和除杂效果好的优势，能够作为小麦粉中呕吐毒素检测的参考方法。参照《GB 5009.111-2016 食品安全国家标准 食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定 》。一样品前处理1.1  样品提取（1）称取2 g样品，再加入20 mL乙腈-水溶液（9+1）混合均匀。（2）涡旋15 min后，6000 r/min离心5 min，取上清液，待净化用。1.2  样品净化（1）向玻璃试管中加入10 mL样品提取液。（2）将净化柱橡胶头从试管顶端插入试管中，并向下压净化柱至试管底端。（3）将净化柱上部净化后的样品提取液取出至样品瓶或EP管中。（4）取5 mL净化提取液，40℃下氮气吹干，用1 mL初始流动相复溶，涡旋30 s溶解残渣，过0.22 μm微孔滤膜，上机分析。Copure® 230多功能净化柱二仪器条件LC方法仪器设备：UltiMate 3000（Thermo Fisher Scientific），配DAD检测器色谱柱：Agilent ZORBAX  C18 (4.6 mm×250 mm，5 μm)流动相：A：甲醇    B：去离子水  流动相梯度：见表1流速：0.8 mL/min柱温：35℃进样体积：50.0 mL检测波长：218 nm表1  流动相洗脱程序LC-MS/MS方法仪器设备：液相色谱-串联质谱联用仪 SCIEX Triple Quad™ 4500色谱柱： C18 ，1.9 um，2.1x100mm 流动相： A：水    B：甲醇流动相梯度：初始95%A（0 min~1 min）95%~5%A（1.1 min~3 min）5%A（3.1 min~3.5min）95%A（3.51min~6.0min）流速：0.3 mL/min柱温：室温进样体积：4.0 mL离子源模式：ESI-检测方式：多离子反应检测（MRM）采集条件：见表2表2 离子选择参数（注：*为定量离子）三实验结果LC方法图1 不同品牌多功能净化柱处理加标样品后的色谱图①小麦粉样品-未净化处理/②Copure®230-净化处理③国内B品牌-净化处理/④国外A品牌-净化处理从图1中可知，经过Copure®230净化处理后，上机液中杂质被明显吸附，色谱图中杂峰更少，目标峰旁边无干扰峰，定量更准确；Copure®230的杂质去除效果明显优于国内B品牌，与国外A品牌相近，回收率在90-120%之间，满足实验使用需求。LC-MS/MS方法表4  LC-MS/MS方法加标回收实验结果从图3中可知，经过Copure®230净化处理后，TIC图中杂质被明显吸附，色谱图中杂峰更少，DON、3A-DON、15A-DON三种目标物回收率在95~110%之间，符合实验要求，整体性能与国外竞品相当。图3 不同品牌多功能净化柱处理加标样品后的TIC色谱图①小麦粉样品-未净化处理/②Copure®230-净化处理③国外A品牌-净化处理/④ 国内B品牌-净化处理四订购信息想了解更多产品信息，可直接访问逗点商城http://www.commashop.cn/allproduct/610