植物中超氧化物歧化酶SOD检测方案(紫外分光光度计)

上海美析仪器有限公司美析仪器 NBT 法测定超氧化物岐化酶(SOD)的应用方案(分光法) 原理 SOD 是含金属辅基的酶。高等植物含有两种类型的 SOD： Mn-sOD 和 cu.Zn-SOD， 它们都催化下列反应： 由于超氧自由基(O2)为不稳定自由基，寿命极短，测定 SOD 活性一般为间接方法。并利用各种呈色反应来测定 SOD 的活力。核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子02一..一，当加入NBT后，在光照条件下， 与超氧自由基反应生成单甲攒(黄色)，继而还原生成二甲攒，它是一种蓝色物质，在560nm波长下有最大吸收。当加入 SOD 时，可以使超氧自由基与H结合结成 H202和02，从而抑制了 NBT 光还原的进行，使蓝色二甲攒生成速度减慢。 在反应液中加入不同量的 SOD 酶液，光照一定时间后测定 560nm 波长下各液光密度值，抑制 NBT光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正比。反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低。 仪器及试剂 美析 UV-1500 紫外可见分光光度计0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS， pH7.8)： A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液：取 Na2HPO412H2O(分子量358.14)71.7g；B 母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取 NaH2PO4-2H20(分子量156.01) 31.2g。分别用蒸馏水定容到1000ml。 0.05mol/LPBS(pH7.8)的配制：分别取A母液(Na2HPO4)228.75ml， B母液(NaH2PO4)21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。 14.5mM甲硫氨酸溶液：称取 1.0818g Met 用磷酸缓冲液友(pH7.8)定容至500ml。 3mM EDTA-Na2 溶液：称取 0.1117g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至 100ml。 60 uM 核黄素溶液：称取 0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定定至100ml， 避光保存。 2.25mM氮蓝四唑(NBT)溶液：称取 0.092g NBT 用 PBS 定容至 50ml， 避光保存。 实验步骤 酶液提取 称取 0.5g(可视情况调整)样品(新鲜叶片或根系)洗净后置于预冷研钵中，分三次加入10ml50mmol/L预冷的磷酸缓冲液(pH7.8)在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下 离心20min，上清夜即为 SOD 粗提液。 酶活性测定 (1)反应混合液配制(以60个样为准)：分别取配好的 Met 溶液162ml， EDTA-Na2溶液 6ml， NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml，混合后充分摇匀； (2)分别取2.9ml 反应混合液和0.1ml(可视情况调整)酶液于指形管中此即反应管；同时做两支对照管，其中1支试管加 2.9ml反应混合液和 0.1ml PBS(不加酶液〉作为最大光还原管，另1支加2.9ml反应混合液和0.1ml PBS 同时用锡箔纸包好遮光用于测定时调零。 (3)将试管置于光照培养箱中在4000 lux 光照25℃下反应 20min； (4)反应结束后以不照光的对照管调零，分别测定各管在560nm下的吸光度 (OD560) 计算结果 已知SOD 活性单位以抑制 NBT 光化还原的50%为一个酶活单位(U)，按下式计算活性n=[(ODmax-OD560)/ODmax]/2 SOD 总活性=[(Ack-AE)xV]/(1/2AckxWxVt)SOD 比活力=SOD 总活性/蛋白质含量 SOD 总活性以鲜重酶单位每克表示(u/g Fw)；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示； Ack 为照光对照管的吸光度； AE 为样品管的吸光度； V为样品液总体积(ml)； Vt 为测定时的酶液用量(ml)； W 为样品鲜重(g>； 蛋白质含量单位为 mg/g。 注意事项 1.酶液提取须在4℃下进行，提取后立即进行测定，冰箱中放几小时活性也会下降； 2.植物中的酚类物质对测定有干扰，制备粗酶液时可加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或 pvpp 等，尽可能除去植物组织中的酚类等次生物质。 3.NBT 反应液配好后过滤除去不溶物立即使用，若置于冰箱中要避光保存，充分摇匀然后使用。 4.加反应液时最好在暗光下进行； 5.核黄素产生02， NBT 还原为蓝甲h都与光照密切相关，照光强度和时间要严格控制。光照培养箱内壁裱糊锡箔纸，使箱内均匀光照约达40u molms， 同时使照光时间一样，选择试 管尽量一致，照光结束后测一个拿一个(最好晚上做)(温度高时照光时间缩短，温度低时延长)； 6.测定活性时加入的酶量，以能抑制反应的50%为佳。(一个酶单位相当于引起反应液达到半抑制时酶的用量，即以能抑制反应50%的酶量为一个 SOD 酶活性单位。) (反应液中加酶液与 PBS 调零差异不大，反应液调零与其它两个则有一定差异。李合生方法：2支 CK 管均以缓冲液代替酶液) 仪器参数 UV-1500UV-1500PC 紫外可见分光光度计 关于我们 上海美析仪器公司简介 上海美析仪器有限公司(以下简称美析)，是一家具有自主知识产权的高新技术企业，美析的仓业理念“科技——因你改变"，并以此为企业宗旨，不断探究、果敢创新。特别是在分析测试仪器领域，，不断开发出先进的产品，使美析成为优质仪器资源源供应者。 美析主营光谱类仪器可见分光光度计、紫外可见分光光度计、原子吸收光谱仪、超微量分光光度计、原子荧光光度计、ICP电感耦合等离子体发射光谱仪、ICP电感耦合等离子体质谱仪，目前，我们的产品已广泛应用于有机化学、无机化学、生物化学、医药、环保、冶金、石油、农业等领域。同时美析利用在产品机械结构、光学设计、电气应用和软件开发方面积累的丰富经验，结合市场的最新实际需求，近期将陆续推出一批全新的分析类仪器。美析的总部及生产基地设在上海，营销中心设在北京，并在江苏、上海、山东三地建有研发基地。为充分利用各地的智力资源，美析与国内外的部分科研单位也进行了深层次的科研合作，不断将科研成果转化为生产力。为更好的服务于广大客户，美析仪器国内设有12家办事机构，度身定制符合您需求的应用解决方案，提高产品的附加值。在不断服务国内用户的同时，美析也与20多个国家的分销机构建立了深度的战略合作关系。 (美析仪器不仅仅只是一家高新技术认证企业，更通过了 CE 认证、FCC 认证、RoHS认证以及国内多项资质审查认证，并有着多项自行研发的光谱类专利版权等等) TEL- SOD是含金属辅基的酶。高等植物含有两种类型的SOD: Mn—sOD和cu.Zn—SOD，它们都催化下列反应:由于超氧自由基(O2）为不稳定自由基，寿命极短，测定SOD活性一般为间接方法。并利用各种呈色反应来测定SOD的活力。核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子02一..一，当加入NBT后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成单甲攒（黄色)，继而还原生成二甲攒，它是一种蓝色物质，在560nm波长下有最大吸收。当加入SOD时，可以使超氧自由基与H结合生成H202和O2，从而抑制了NBT光还原的进行，使蓝色二甲攒生成速度减慢。在反应液中加入不同量的SOD酶液，光照一定时间后测定560nm波长下各液光密度值，抑制NBT光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正比。反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低。