细胞、组织样本中超声粉碎检测方案(细胞破碎仪)

ACTIOE MOTIFEnabling Epigenetics Research TECHNOTE： PIXUL"样本处理――蛋白组学相关应用 TECHNOTE 使用PIXULTM对蛋白组学样本进行处理 背景介绍 在蛋白组学研究中，由于蛋白组的复杂性，样本的制备环节尤其具有挑战性。在样本制备过程中，通常使用超声的方式获得尽可能多且种类全面的蛋白质。 而在蛋白组学分析方面，质谱因其具有准确、灵敏和灵活等特点，已成为蛋白组学分析的金标准。近年来，质谱也已经被应用到临床研究领域中。 在这样的背景下，可重复地、高通量地处理蛋白组样本，变得尤为重要。 PIXUL--可重复、高通量处理蛋白组样本 Active Motif 推出的PIXULTM 多样本一体式超声仪能够同时设置12种不同的超声条件处理96个样本，同时兼具高通量和多样本的处理能力。 在此篇技术资料中，我们将通过比较PIXULTM 多样本一体式超声仪和标准探头式超声仪对HEK293T细胞和小鼠肝脏组织样本的裂解结果，展示PIXUL在样本处理方面的优良性能。 我们利用两种不同的超声方式裂解样本提取蛋白，将样本在LTQ Orbitrap Elite仪器上进行LC-MS分析。通过评估常见的质量控制参数，包括蛋白质提取效率、鉴定的蛋白质数量和蛋白质修饰的存在，对两种超声处理方法进行比较。 HEK293T 细胞样本 PIXUL处理的样本蛋白浓度与标准方法相当 蛋白浓度测定 通过BCA法测定三组生物学重复的蛋白质浓度，比较PIXUL和标准探头式超声仪处理样本之间蛋白质产量的差异。 图一：BCA测定蛋白质浓度 同时使用PIXUL和探头式超声仪处理HEK293T细胞，三次实验重复，使用BCA测定蛋白质浓度(ug/ml)。 橘色：PIXUL超声仪处理后样本；绿色：探头式超声仪处理后样本 从图一我们可以看出， PIXUL处理的样本蛋白浓度在4890-6543 ug/ml， 探头式超声仪处理的样本蛋白浓度在4247-4761 ug/ml。表明与标准方法(探头式)相比，使用PIXUL时的蛋白质产量与其相似，甚至略高。 TECHNOTE PIXUL处理的样本识别肽段和蛋白数量与标准方法相当 肽段识别 样本名称 识别肽段数 识别蛋白数 HEKTPIXUL_rep1 9497 2404 HEKTPIXUL_rep2 10020 2431 HEKTPIXUL_rep3 2268 9080 HEKTProbe_rep1 9619 2458 HEKTProbe_rep2 9577 2480 HEKTProbe_rep3 9559 2381 表一：识别肽段和蛋白质的数量比较 上三行代表的是PIXUL处理的三个样本，下三行代表的是探头式超声处理的三个样本。 6个样本经过LC-MS/MS检测， 使用MaxQuant算法(版本1.6.17.0)默认参数。 (falsediscovery rate=1%)，根据人类Swiss-Prot参考蛋白质组数据库 (www.uniprot.org) (数据库发布版本为2021_01，包含20，621条蛋白质序列)对质谱进行搜索。 经比较， PIXUL处理样本产出肽段数在9080-10020，探头式超声处理样本产出肽段数为9559-9619，从结果中我们可以看出，虽然PIXUL的重复间偏差略高，但PIXUL和探头式超声处理的样本识别肽段和蛋白的数量相当。 PIXUL处理的样本质量符合要求不完全酶解位点数目 (Missed cleavages) 测定 图二：不完全酶解位点数目 (missed cleavages) 占比 接下来对不完全酶解位点数目的数量进行了评估。不完全酶解代表了胰蛋白酶没有按照预期裂解多肽。在数据库搜索过程中，最多允许2次不完全酶解作为标准设置，因此可以评估有0、1或2次未酶解事件的肽的数量。 PIXUL(橙色)和标准探头式超声(绿色)的平均不完全酶解百分比显示。PIXUL和标准探头式超声的不完全酶解率是相当的 (33.79 vs 33.35)。此外，0、1或2个不完全酶解事件的比例也是相当的，这表明与标准探头式超声相比，用PIXUL制备的样品的不完全酶解事件在正常可接受范围内。 总的来说，考虑到没有进行(如内切酶)预消化的事实，不完全酶解的数量是可以接受的。 TECHNOTE PIXUL处理的样本蛋白修饰百分比与标准方法相当 蛋白修饰评估 蛋白质N端乙酰化和氧化蛋氨酸残基(蛋氨酸亚砜)的平均百分比被评估为检测蛋白质修饰情况的标准和超声制备样本的一般质量参数。 图三：蛋白质N-端乙酰化和氧化蛋氨酸的平均百分比 左图： PIXUL(橙色)和标准探头式超声(绿色)蛋白质N端乙酰化的平均百分比。右图：PIXUL(橙色)示标准探头式超声(绿色)的氧化蛋氨酸的平均百分比。 在使用PIXUL处理的样本中，乙乙化的蛋白质N端百分比(2.7%)!以及氧化的蛋氨酸百分比(11.72%)与使用标准探头式超声观察到的百分比(2.47%，11.09%)在同一范围内。 综上，对于标准培养细胞的蛋白质组学样本制备，PIXUL可以提供与标准探头式超声样本制备方案一致的结果，并且具有更高的产量。 图四：BCA法蛋白浓度测定橘色：PIXUL超声仪处理后样本；绿色：探头式超声仪处理后样本；紫色：被选作进一步分析的样本。P-value_=0.00048 P-value=0.00552 P-value.=0.014 P-value=0.022如图4所示，用标准探头式超声处理的6个样本和PIXUL处理的8个样本在4个不同时间点(5分钟、15分钟、30分钟和60分钟)的比较。PIXUL处理蛋白浓度范围在1409-2710 pg/ml，标准方法探头式超声的蛋白浓度范围在1449-1764ug/ml，表明与标准方法相比， PIXUL的处理有相近的产出，甚至略高。此外， PIXUL不同超声时间的样本之间没有显著的区别，说明5 min的超声时间已经足以产出用于下游分析的蛋白质浓度。 小鼠肝脏组织样本PIXUL处理的样本蛋白浓度与标准方法相当蛋白浓度测定通过BCA测定每个时间点的蛋白质浓度，比较PIXUL和标准探头式超声之间的蛋白质产量的差异。3000250020001500E1000500n 15min_1niininm5m5m5min_15min_115min_2n_mi1515min_1515min_(15min_7nmi1530mi30min_23omin_：30min ，.6nnninmmiin_7mimi30omin_2303om306omin 166o6omin_6omin_66omineobPr TECHNOTE PIXUL处理的样本识别肽段和蛋白数量与标准方法相当 肽段识别 TissuePIXUL5min_rep1 7319 1441 TissuePIXUL5min_rep2 7265 1434 TissuePIXUL15min_rep1 728o 1359 TissuePIXUL15min_rep2 7359 1375 TissuePIXUL3omin_rep1 7716 1457 TissuePIXUL3omin_rep2 8380 1689 TissuePIXUL6omin_rep1 7345 1493 TissuePIXUL6omin_rep2 7721 1493 TissuePIXUL6omin_rep1 7345 1493 TissuePIXUL6omin_rep2 7721 1493 表二：识别肽段和蛋白质的数量比较 上八行代表在PIXUL上运行的四种不同超声时间中每一种的两个重复数据，下两行代表标准探头式超声的重复数据。 尽管两种方法之间蛋白浓度有一定的差异，但最后获得的识别肽段数和蛋白数总体上是相似的。说明用PIXUL处理组织样本也能得到优良的数据结果。 (LC-MS/MS分析： MaxQuant算法(版本1.6.17.0)，默认参数， false discovery rate=1%， 所用数据库 Swiss-Prot (www.uni-prot.org) (数据库发布版本为2021_01，包含20，621个蛋白质序列))。 两组识别肽段和蛋白质的数量差异不显著 (PIXUL： 7265-8380，标准：7803-8124)，表明两种方法处理小鼠肝组织提取蛋白的能力相当。此外，通过检测不同时间点肽段的识别数量，说明5分钟的超声处理足以完全和有效地裂解肝脏组织。 PIXUL处理的样本质量符合要求不完全酶解位点数目(Missed cleavages) 测定 不完全酶解位点百分比平均值 图五：不完全酶解位点数目 (missed cleavages)) D占比 橙色、紫色、黑色、灰色：PIXUL处理后样本；绿色：探头式超声处理后样本 在小鼠肝脏样本中，我们同样检测了胰蛋白酶的不完全酶解位点数目。PIXUL和标准探头式超声结果的总不完全酶解相差无几 (30.74-35.72 vs36.05))。 此外发生0、1或2个不完全酶解事件的比例是相当的，这表明与标准探针超声仪相比，用PIXUL制备的样品有同等程度的不完全酶解现象。在PIXUL不断增长时间的处理下，0、1或2次不完全酶解的比例并没有随之增多。 总的来说， PIXUL处理对后续胰蛋白酶的酶切效率不会造成额外的影响，也能得到优良的酶切结果。 PIXUL处理的样本蛋白修饰百分比与标准方法相当蛋白修饰评估 蛋白质N端乙酰化和氧化蛋氨酸残基(蛋氨酸亚砜)的平均百分比被评估为检测蛋白质修饰情况的标准和超声制备样本的一般质量参数。 S=O 图六：蛋白质N端乙酰化和氧化蛋氨酸的平均百分比 左图： PIXUL(橙色)和标准探头超声仪(绿色)蛋白质N端乙酰化的平均百分比 右图：氧PIXUL(橙色)和标准探头超声仪(绿色)氧化蛋氨酸的平均百分比 用PIXUL处理的样本中乙酰化蛋白N-末端的百分比以及氧化甲硫氨酸的百分比与用标准探头式超声处理的样本无显著差异。 这些结果表明，对于作为动物组织样本代表的小鼠肝组织蛋白质组学样本制备， PIXUL多样本一体式超声仪与探头式超声样本制备方案的结果相当，且具有更高的通量，同批处理大量样本的能力更强. TECHNOTE 附录：样本制备方法 HEK293T细胞样本 使用Protifi S-TrapTM样本处理技术进行MS-分析的样本制备。简而言之，将5.4x106个HEK 293T细胞重悬于含有5%SDS和50 mM TEAB pH 8.5的缓冲液中。细胞裂解通过超声处理得到加强。标准方法是使用探头式超声仪(VCX130，3mm探头， Sonics and Materials， Newtown， USA) 进行裂解，超声参数为：3x15s脉冲，15W输出，各个脉冲之间冰上间歇30s。 PIXUL超声处理方式：5min的运行时间， 50 pulses的脉冲，20Hz的burst rate， 每个样品等分入两个孔中，在超声完成后合并。 经过超声处理后，加入DTT和IAA以还原和烷基化蛋白质，在37℃下用1pg胰蛋白酶消化蛋白质。取1.5pg 多肽混合物在LTQ Orbitrap Elite仪器上用nano LC-MS/MS进行分析，使用标准的2 hours runs和CID (Collision-induced dissocia-tion) 片段化方式。 小鼠肝脏组织样本 使用Protifi S-TrapTM样本处理技术进行MS-分析的样本制备。简而言之，100 mg新鲜小鼠肝脏组织放置于含5% SDS的50 mM TEAB (pH=8.5)缓冲液中，使用美天旎组织处理器 (MACS tissue dissociator， Miltenyi Biotech)将肝脏组织研磨成匀浆。标准方法包括使用探头超声仪 (VCX130，3mm探头， Sonics and Materials， Newtown， USA) 对样品进行超声处理，脉冲时间为3x15s，输出功率为15W，各个脉冲之间样品冰上放置30秒。 PIXUL超声处理方式：运行时间分别设置5， 15， 30， 60 min， 50 pulses的脉冲，20Hz的burst rate，每个样品分八个孔，在超声完成后再合并。 经过超声处理后，加入DTT和IAA以还原和烷基化蛋白质，在37℃下用1pg胰蛋白酶消化蛋白质。取1.5 pg多肽混合物在LTQ Orbitrap Elite仪器上用nano LC-MS/MS进行分析，使用标准的2 hours runs和CID (Collision-induced dissocia-tion)片段化方式。 Enabling Epigenetics Research Active Motif (中国) 上海市静安区万航渡路889广场1602BMobile： 185 2136 2870Direct： 021-2092 6090techchina@activemotif.com www.activemotif.com 表观遗传研究专家 中国区独家代理商 Proteintech 中国公司湖北省武汉市东湖新技术开发区高新大道666号D3-3Direct： 027-8753 1629proteintech-cn@ptglab.com www.ptgcn.com ACTIVE MOTIFEnabling Epigenetics Research ctivemotif.com 背景介绍在蛋白组学研究中，由于蛋白组的复杂性，样本的制备环节尤其具有挑战性。在样本制备过程中，通常使用超声的方式获得尽可能多且种类全面的蛋白质。而在蛋白组学分析方面，质谱因其具有准确、灵敏和灵活等特点，已成为蛋白组学分析的金标准。近年来，质谱也已经被应用到临床研究领域中。在这样的背景下，可重复地、高通量地处理蛋白组样本，变得尤为重要。PIXUL——可重复、高通量处理蛋白组样本Active Motif 推出的PIXUL 多样本一体式超声仪能够同时设置12种不同的超声条件处理96个样本，同时兼具高通量和多样本的处理能力。在此篇技术资料中，我们将通过比较PIXULTM 多样本一体式超声仪和标准探头式超声仪对HEK293T细胞和小鼠肝脏组织样本的裂解结果，展示PIXUL在样本处理方面的优良性能。我们利用两种不同的超声方式裂解样本提取蛋白，将样本在LTQ Orbitrap Elite仪器上进行LC-MS分析。通过评估常见的质量控制参数，包括蛋白质提取效率、鉴定的蛋白质数量和蛋白质修饰的存在，对两种超声处理方法进行比较。