酶解肽段标准品中单细胞蛋白组检测方案(液相色谱仪)

thermoscientific热线 8008105118电话4006505118www.thermofisher.com仅用于研究目的。不可用于诊断目的。C 2020 Thermo Fisher Scientific Inc. 保留所有权利。所有商标均为 Thermo Fisher Scientific Inc.及其子公司的资产，除非另有指明。 FAIMS Pro联合Orbitrap Fusion Lumos提升单细胞蛋白组水平的鉴定与定量性能 黄敏，周岳赛默飞世尔科技(中国)有限公司 关键词： FAIMS Pro、单田胞蛋白组， MSpep search 前言 实验条件 常规蛋白组学一般为基于细胞群体内的研究，因此不可避免地会将大量细胞内的信息平均化，已经越来越难以满足对生命功能更加深入探究的需要。从单细胞层面去了解细胞特征以及彼此之间的相互影响，可以为生物系统中细胞间的异质性提供更宝贵的信息，因此有着越来越大的迫切需求。 实验材料 Hela 酶解肽段标准品(PierceTMHeLa Protein Digest Stan-dard， 88323)用0.1%甲酸，2%乙腈溶液溶解，并稀释至10ng/uL， 5ng/pL， 2ng/uL， 1ng/pL， 500pg/pL和200pg/pL。 纳升液相色谱质谱联用(nano LC-MS) 另外，一些样品量受限的样品，例如具有高活力和转移潜能的CTC细胞(循环肿瘤细胞)，它们浓度极低且罕见，而这正是单细胞分析所擅长的领域。还有一些其它重要但样品量有限的样品，同样可从中受益，包括外泌体，细针穿刺和活检组织切片样品等。 高效液相色谱仪： Thermo Ultimate3000 RSLCnano； 色谱柱： AcclaimTM PepMapTM 100 C18，50pm*15cm， 2pm(164943)； 鉴于蛋白质不具有直接扩增的特性，以及蛋白质组学分析灵敏度的限制，目前对于少量乃至单细胞内蛋白质的检测极具挑战性。 流动相：A：0.1%甲酸水；B：0.1%甲酸，80%乙腈；梯度流速见表1。 表1液相梯度 本文中我们考察了Orbitrap Fusion Lumos 联合FAIMS Pro对不同上样量(从200pg到10ng)的Hela酶解肽段的鉴定及定量性能。FAIMS Pro接口是一个在线气态分离的装置，可有效富集目标离子，排除污染和干扰物，可显著提高蛋白组学的分析深度。60min梯度时，200pgHela肽段(相当于单个人类体细胞细胞蛋白量)，搭载FAIMSPro可鉴定1259个蛋白，4056条肽段，比不加FAIMS分别提高216%和298%。此外，三次平行进样的蛋白和肽段丰度CV中位数分别小于10%和12%，且上样量与所得的肽段丰度总和存在良好的线性关系(R2>0.99)。2ngHela肽段，不搭载FAIMS时的动态范围约为4个数量级，搭载FAIMS后，动态范围提高至超过5个数量级。 时间(min) 流速(nL/min) %B 0 100 3 2 100 5 52 100 18 54 100 99 60 100 99 61 200 3 70 200 3 质谱仪： ThermoScientificcFFusionLumos三合一质谱仪；喷雾电压：2.2kV；毛细管温度：320℃；一级Orbitrap分辨率240K， Normalized AGC Target 250%，最大离子注入时间250ms；动态排除时间60s；；二级HCD碎裂，碎裂能量NCE30，离子阱扫描，扫描速度Rapid， Normalized AGC Target300%， 最大离子注入时间分别为200ms(200pg和500pg上样量)，100ms(1ng上样量)， 80ms(2ng和5ng上样量)和50ms (100ng上样量)； Cycle time 3s； FAIMS Pro CV电压为-45V和-60V。 数据分析 数据分析使用Proteome Discoverer 2.4版本，分别使用Sequest和MSpep search方法进行蛋白组鉴定， FDR设置为1%，其中MSpep search中使用NIST_Human_Orbitrap_HCD， NIST_Pro-teome_Human_synthetic_HCD和ProteomeTools_HCD28_PD谱图库。 实验结果 1.FAIMS Pro CV电压的优化 搭载FAIMSPro时， 需首先对FAIMS的CV电压进行优化。 以200pg上样量例例，比较单个电压，以及两个电压时的鉴定结果，其中联合使用CV电压-45V和-60V时，蛋白和肽段数目均高于其它电压设置(图1)，后续其它上样量按此设置进行。 图1不同CV电压时的蛋白和肽段鉴定结果(数据分析采用数据库检索Sequest) 2. MS2 最大离子注入时间优化 增加二级的最大离子注入时间可以提高谱图的质量，有利于低上样量时的肽段鉴定，但同时会减少谱图数目，反而会减少肽段和蛋白鉴定数目，因此，需要针对不同的上样量进行优化。图2以200pg为例，可知200pg上样量时的最佳二级离子注入时间为200ms。同样可得，500pg、1ng、2ng、5ng和10ng上样量时的最佳二级离子注入时间分别为200ms、100ms、80ms、80ms和50ms。 图2200pg肽段上样量时，不同MS2最大离子注入时间下的肽段和蛋白鉴定结果(数据分析采用数据库检索Sequest) 3.搭载FAIMS Pro，不同肽段上样量的分析结果 完成参数优化后，接着我们对不同肽段上样量进行分析，每个上样量重复三次，代表性色谱图如图3所示。 图3搭载FAIMS Pro， 不同肽段上样量的代表性色谱图 数据分析分别采用数据库检索Sequest和谱图库检索MSPepsearch方法，结果如图4所示。60min梯度，结合FAIMS后，200pg Hela肽段(相当于单个细胞)， Sequest 方法鉴定924个蛋白，2427条肽段；而采用MSpep search 方法可提升至1259个蛋白，4056条肽段，比数据库检索方法提升了36%和67%。 图4搭载FAIMS Pro， 不同肽段上样量的蛋白和肽段鉴定结果(对比Sequest和MSPep search方法) 除了鉴定性能以外，我们还关注Orbitrap Fusion Lumos联合FAIMS Pro在单细胞蛋白组水平上的LFQ定量性能(图5)。不同肽段上样量，三次重复进样的蛋白和肽段丰度CV值中位数均分别小于10%和12%(图5A)。另外，上样量与肽段丰度和之间存在良好的线性关系(R2>0.99)) ((图5B)。 图5 搭载FAIMS Pro在单细胞蛋白组水平的定量性能。A，三次重复进样的蛋白和肽段丰度CV值中位数；B，上样量与肽段丰度和的线性曲线 4.未搭载FAIMS Pro， 不同肽段上样量的分析结果 为了更好的对比搭载FAIMS Pro后的优势，我们同样进行了未搭载FAIMS Pro时，不同肽段上样量的分析，除了FAIMS特定参数之外，其余参数一致。结果如图6-图8所示。 图6未搭载FAIMS Pro，不同肽段上样量的代表性色谱图 对比图3可以发现，未搭载FAIMS Pro时， 在低肽段上样量时，肽段的信号基本被基线信号所掩盖，表明了FAIMS可有效去除污染和干扰物的信号，从而可有更多的肽段母离子作为候选离子进行二级碎裂。 图7未搭载FAIMS Pro， 不同肽段上样量的蛋白和肽段鉴定结果(对比Sequest和MSPep search方法) 未搭载FAIMS Pro时， 200pg Hela肽段(相当于单个细胞)， Sequest 方法鉴定351个蛋白，813条肽段；而采用MSpep search 方法可提升至399个蛋白，1029条肽段，比数据库检索方法提升了14%和25%(图7)。另外， 2ng Hela肽段(相当于10个细胞)， Sequest 鉴定1436个蛋白，4060条肽段； MSpep search 鉴定1668个蛋白，5511条肽段，，可作为单细胞类实验的QC样品。 图8未搭载FAIMS Pro在单细胞蛋白组水平的定量性能。A，三次重复进样的蛋白和肽段丰度CV值中位数；B，上样量与肽段丰度和的线性曲线 同样的，我们考察了未加载FAIMSS Pro时的单细胞蛋白组水平上LFQ定量性能(图8)。不同肽段上样量，三次重复进样的蛋白和肽段丰度CV值中位数均分别小于10%和12%。另外，上样量与肽段丰度和之间存在良好的线性关系(R2>0.99)。 5.是否搭载FAIMS Pro的比较结果 最后，我们对比了是否搭载FAIMS Pro时的鉴定和定量性能。60min梯度， 200pg Hela肽段(相当于单个细胞)，使用MSPepsearch时， 搭载FAIMS可鉴定1259个蛋白，4056条肽段，比不加FAIMS分别提高216%和298%(图9)。这说明FAIMS Pro联合Or-bitrao Fusion Lumos相比不搭载FAIMS可大大提升单细胞蛋白组水平的鉴定深度。 图9是否搭载FAIMS Pro， 不同肽段上样量的蛋白和肽段鉴定比较结果 此外，2ng上样量时(相当于10个细胞)，未搭载FAIMS时，肽段强度的动态范围约为4个数量级，搭载FAIMS后，肽段强度的动态范围提高至超过5个数量级(图10)。这说明FAIMS Pro不只可提升单细胞蛋白水平的鉴定性能，还可有效扩大动态范围，提升定量性能。 图102ng上样量，是否搭载FAIMS Pro时的肽段强度动态范围对比 结论 FAIMS Pro 通过实现在线气相分离，可有效去除蛋白组学分析中常见的污染和干扰物，为基于高分辨质谱的蛋白组学分析增加多一维度的分离。本文将其应用在单细胞蛋白组水平的分析，经过方法优化后， FAIMS Pro联合Orbitrap Fusion Lumos可显著提升单细胞蛋白组水平的鉴定深度与定量性能。其中，60min梯度， 200pg Hela肽段(相当于单个细胞)，搭载 FAIMS可鉴定1259个蛋白，4056条肽段，比不加FAIMS分别提高216%和298%；2ng上样量时(相当于10个细胞)，搭载FAIMS时，可将肽段强度的动态范围从4个数量级提高至超过5个数量级。该方法可用于单细胞水平以及其它少量样品的蛋白组学分析。 FAIMS Pro 通过实现在线气相分离，可有效去除蛋白组学分析中常见的污染和干扰物，为基于高分辨质谱的蛋白组学分析增加多一维度的分离。本文将其应用在单细胞蛋白组水平的分析，经过方法优化后，FAIMS Pro联合Orbitrap Fusion Lumos可显著提升单细胞蛋白组水平的鉴定深度与定量性能。其中，60min梯度，200pg Hela肽段（相当于单个细胞），搭载FAIMS可鉴定1259个蛋白，4056条肽段，比不加FAIMS分别提高216%和298%；2ng上样量时（相当于10个细胞），搭载FAIMS时，可将肽段强度的动态范围从4个数量级提高至超过5个数量级。该方法可用于单细胞水平以及其它少量样品的蛋白组学分析。