蓝蛤中工艺研究检测方案(感官智能分析)

中国调味品China Condiment第46卷第1期2021年1月基础研究 蓝蛤超高压辅助酶解工艺研究 步营1，王飞，胡显杰1.2，朱文慧1*，李学鹏1，毕蕾3，王玉亭 (1.渤海大学食品科学与工程学院，生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心，辽宁锦州 121013；2.大连工业大学海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心，辽宁大连 116034；3.抚顺独骨轩骨神生物技术股份有限公司，辽宁抚顺 113122；4.荣成协食食品股份有限公司，山东荣成 246309) 摘要：以蓝蛤为原料，采用正交试验优化超高压酶解条件，通过感官、电子鼻和电子舌等分析超高压对酶解液风味的影响。结果表明，在250 MPa压力下处理60 min 后得到的酶解液风味最佳，在此条件下氨基酸态氮含量为 0.39 g/dL，水解度为45.09%。经感官评价、电子鼻和电子舌分析，超高压处理酶解液苦腥味降低，鲜味值增大，酶解液味道鲜美，品质佳，超高压辅助酶解是制备优质海鲜调味基料的一种新型技术。 关键词：蓝蛤；超高压；酶解工艺；风味 中图分类号：TS201.1 文献标志码：A doi：10.3969/j.issn. 1000-9973.2021.01.011 文章编号：1000-9973(2021)01-0057-06 Study on UItra-high Pressure Assisted Enzymatic Hydrolysis Process of Aloididae aloidi BU Ying， WANG Fei， HU Xian-jie， ZHU Wen-hui， LI Xue-peng， BI Lei， WANG Yu-ting (1.National &. Local Joint Engineering Research Center of Storage， Processing and Safety ControlTechnology for Fresh Agricultural and Aquatic Products， College of Food Science andEngineering， Bohai University， Jinzhou 121013， China； 2. Collaborative InnovationCenter of Marine Food Deep Processing Key Technologies Jointly Built by Provincial Departments， Dalian Polytechnic University， Dalian 116034， China； 3. Dufengxuan Gushen Biological Technology Co.， Ltd.， Fushun 113122， China； 4. Rongcheng Xiehui Foods Co.， Ltd.， Rongcheng 264309， China) Abstract： Using Aloididae aloidi as the raw material， orthogonal experiment is used to optimize theconditions of ultra-high pressure enzymatic hydrolysis. The effect of ultra-high pressure on the flavorof enzymatic hydrolysate is analyzed by sensory， electronic nose and electronic tongue.The resultsshow that the best flavor is obtained at 250 MPa pressure with 60 min treatment. Under theseconditions， the content of amino acid nitrogen is 0. 39 g/dL and the degree of hydrolysis is 45.09%.Through sensory evaluation， electronic nose and electronic tongue analysis， the bitterness and fishysmell of the enzymatic hydrolysate treated with ultra-high pressure are decreased and the value ofumami is increased， and the taste and quality of the enzymatic hydrolysate are good..Ultra-highpressure assisted enzymatic hydrolysis is a new technology for preparing high-quality seafoodseasoning. Key words： Aloididae aloidi； ultra-high pressure； enzymatic hydrolysis； flavor ( 收稿日期：20 20-07-26 * 通讯作者 ) ( 基金项目： “十三 五 ”国 家重点 研发计划项 目(20 1 6Y FD0 400 705)； 辽 宁兴辽 英 才项 目( XL Y C 1 8 07 13 3 ) ) ( 作者 简介：步步 (1981一 ) ， 男 ，工 程师，硕 士，研究方向 ：水 产品加工及 贮 藏； ) ( 朱 文 慧(1 98 2 一) ， 女， 副 教 授 ， 博 士， 研 究方 向 ：水产 品加 工及 贮 藏。 ) 我国是世界上最大的贝类养殖国，贝类养殖已经成为沿海海水养殖业的支柱之一。据统计，2018年我国海水养殖贝类总产量达1463.51万吨，占贝类总产量的91.93%，其中，蛤类占海水养殖贝类总产量的27.88%。蓝蛤(Aloididae aloidi)是盛产于我国沿海的一种低值海洋贝类。蓝蛤肉肉质鲜美，营养丰富，且粗蛋白含量相比其他贝类较高，因此成为酶法制备呈味肽的优质原料2。水产蛋白质在酶水解后经常会产生苦味，使用传统的化学和热处理脱腥脱苦方法会严重破坏水产品品质和营养价值3，这使得酶法水解在水产工业上的应用受到了较大的限制。 超高压(ultra-high pressure，UHP)在水产品加工行业逐渐受到关注，Kaur等在室温(25±2)℃条件下，研究了不同压力处理后黑虎虾的品质及货架期变化；邵懿等研究发现，100 MPa高压有利于鳗鱼内源酶对鳗鱼蛋白的水解，外加风味蛋白酶对高压辅助水解效果有加强作用。Maria 等研究发现，超高压处理能够增加球蛋白的水解度，在400 MPa下处理25 min 达到最大水解度。然而，针对超高压同时处理底物和酶的酶解工艺相关的系统研究，在水产方面鲜见报道。 鉴于此，本研究以蓝蛤为研究对象，利用超高压对其进行高压酶解处理，旨在完善和丰富超高压在水产应用方面的基础理论，为超高压酶解的加工利用提供了理论依据。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 蓝蛤(鲜活)：购于帛州市林西水产市场；风味蛋白酶(500 mg)、复合风味蛋白酶(11039)：食品级，北京市诺维信投资有限公司；0.05 mol/L氢氧化钠标准滴定溶液：天津市光复精细化工研究所。 1.2 仪器与设备 HPP. L2-600/0.6超高压设备 天津华泰森淼公司；HH-4数显恒温水浴锅 常州国华电器有限公司；Biofuge Stratos 台式冷冻高速离心机 美国ThermoFisher 公司；Kjeltec 8400 全自动定氮仪 瑞典 Foss公司；SA-402B电子舌 日本Insent公司；PEN3电子鼻 德国 Airsense 公司。 1.3 酶解液的制备 将鲜活的蓝蛤静置于4%的人工海水(海水晶配制)中吐沙，每隔2h换1次水溶液，至吐沙完成，捞起，沥干，冷冻。在0℃下去壳取肉，打碎，以料水比1：1，选取复合蛋白酶和风味蛋白酶，加压或不加压处 理，在酶解温度50℃、酶解pH 7.0、酶解时间4h的条件下，对酶添加量之比(两种酶酶加总量为0.4%)、压力、给压时间这3个因素进行单因素试验及正交优化，测定酶解液氨基酸态氮和水解度值。 1.4 超高压辅助酶解条件的确定 1.4.1 单因素试验 在一定条件下，酶解完成后，样品置于100℃沸水中灭酶10 min，离心(8000×g，20 min)，取上清液备用。 1.4.1.1 酶添加量之比的确定 酶添加量之比(复合蛋白酶：风味蛋白酶)为0：4、1：3、1：1、3：1、4∶0，压力为150 MPa，给压时间为60 min。 1.4.1.2 压力的确定 酶添加量之比(复合蛋白酶：风味蛋白酶)为3：1，压力为100，150，200，250，300 MPa，给压时间为60 min. 1.4.1.3 给压时间的确定 酶添加量之比(复合蛋白酶：风味蛋白酶)为3：1，压力为250 MPa，给压时间为30，40，50，60，70 min。 1.4.2 正交试验 在单因素试验基础上，以酶添加量之比、压力、给压时间为影响因素进行L(3)正交试验1，通过测定氨基酸态氮含量和水解度，选择最优水平组合，因素水平设计见表1. 表1 正交试验因素与水平 Table1 The factors and levels of orthogonal experiment 水平 因素 A酶添加量之比 B压力(MPa) C加压时间(min) 1 1：1 150 40 2 3：1 200 50 3 4：0 250 60 1.5 试验方法 1.5.1 氨基酸态氮的测定 采用甲醛滴定法，参考王琳等的方法进行氨基酸态氮的测定。 1.5.2 水解度的测定 DH(%)=水解液中氨基酸态氮含量/原料中总氮含量。 (1) 式中：原料中总氮含量采用凯式定氮法测定. 1.5.3 感官评价 由10名经过培训小组成员(5名男性，5名女性；年龄在23~25岁)对不同压力、不同给压时间的酶解 液进行品评。首先，对他们在滋味、气味、色泽3个方面进行培训；其次，在25℃下，小组成员单独接受随机3位数的样本和蒸馏水，以便在样品之间漱口。一组测试结束后，小组成员休息5 min，然后对另外5个样本再次进行感官品评19-10]，具体评分标准见表2. 表2 感官评价权重表 Table 2 The sensory evaluation weight table 项目及权重 评分标准 评分 滋味(40%) 没有腥苦味 17~20 有淡淡的腥苦味 13~16 能接受的腥苦味 9~12 不太可以接受的腥苦味 5~8 难以忍受的腥苦味 0~4 气味(30%) 有芳香味 25~30 带点腥味，而且不影响整体感官 19~24 带点腥味，但可以接受 13~18 有腥味，勉强接受，对品质有影响 7~12 有明显的腥味，完全不能接受 无涩味 0~6 25~30 色泽(30%) 淡黄色偏亮 19~24 淡黄色 13~18 黄色 7~12 黄色偏棕色 0~6 1.5.4 电子舌的测定 参照郑舒文等的方法改进进：将蓝蛤酶解液按体积比比释10倍，过滤(0.45，0.22um的滤膜)，取80 mL样液置于电子舌测试杯中，对其苦、鲜、苦和鲜味的回味进行测定，以基准液做空白对照。 1.5.5 电子鼻分析 电子鼻是模拟人体嗅觉，利用传感器对10类挥发性化合物进行鉴定识别的新型无损检测技术。传感器由10种金属氧化物半导体型化学传感元件组成121，每种传感元件对应的主要敏感物质质表3。 表 3 化学传感器及其对应的敏感物质类型 Table 3 The chemical sensors and their correspondingsensitive substances types 阵列序号 金属氧化物传感器名称 性能描述 MOS 1 W1C 芳香成分 MOS 2 W5S 灵敏度大，对氮氧化合物很灵敏 MOS 3 W3C 氨水，对芳香成分灵敏 MOS 4 W6S 主要对氢气有选择性 MOS5 W5S 烷烃芳香成分 MOS 6 WIS 对甲烷灵敏 MOS 7 W1W 对硫化物灵敏 MOS 8 W2S 对乙醇灵敏 MOS 9 W2W 芳香成分，对有机硫化物灵敏 MOS 10 W3S 对烷烃灵敏 样品处理：用50mL的烧杯，称量5g左右的待测样品，用保鲜膜封口，在室温下平衡30 min。在25℃环境中运用电子鼻传感器对样品进行检测。检测时间120s，进样流量和内部流量均为600 L/min，数据采集时间为 85 s 和90 s13]. 1.5.6 数据分析 每个处理进行3次重复，采用软件 SPSS 19.0进行ANOVA分析和正交试验数据分析，并以P<0.05表示差异显著，采用 Origin 9.1作图。 2 结果与分析 2.1 超高压酶解工艺的确定 2.1.1 酶添加量之比对酶解程度的影响 在压力150 MPa、给压时间60 min 的条件下，研究了不同酶添加量之比(复合蛋白酶：风味蛋白酶)对蓝蛤酶解液氨基酸态氮和水解度的影响，见图1。 图1 不同酶添加量之比对蓝蛤酶解液氨基酸态氮和水解度的影响 Fig.1 The effect of different ratios of enzyme additiveamount on amino acid nitrogen and hydrolysisdegree of Aloididae aloidi hydrolysate 由图1可知，氨基酸态氮和水解度在不同酶添加量之和作用下呈上升趋势，且差异显著(P≤0.05)。结合酶解液风味考虑，单酶(复合蛋白酶)酶解的酶解液味苦，腥味重，不能很好地改善酶解液的风味，故选取复合蛋白酶和风味蛋白酶为3：1的比例用于下一 步试验，并将(复合蛋白酶：风味蛋味酶)1：1、3：1、4：0作为正交试验分析条件以确定最佳添加量。 2.1.2 压力对酶解程度的影响 在酶添加量(复合蛋白酶：风味蛋白酶)之比3：1、给压时间 60 min 的条件下，研究了不同压力对蓝蛤酶解液氨基酸态氮和水解度度影响，见图2。 0.32- 图2 不同压力对蓝蛤酶解液氨基酸态氮和水解度的影响 Fig. 2 The effect of different pressures on amino acidnitrogen and hydrolysis degree ofAloididae aloidi hydrolysate 由图2可知，氨基酸态氮和水解度在不同压力作用下呈先上升后下降的趋势，在250 MPa时出现最大值，且差异显著(P<0.05)。在100~250 MPa 时，氨基酸态氮和水解度缓慢上升，在压力≥250 MPa时，氨基酸态氮和水解度直线下降，且氨基酸态氮和水解度低于常压酶解值。有可能是在一定压力下，酶三、四级结构发生变化，改变了酶切位点，提高了酶活性，使水解能力增强；当压力超过临界点时，酶结构被破坏，酶失活或变性，使水解能力降低14。故选取250 MPa用于下一步试验，并将150，200，250 MPa 作为正交试验分析条件以确定最佳压力。 2.1.3 给压时间对酶解程度的影响 在酶添加量之比(复合蛋白酶：风味蛋白酶)3：1、压力150 MPa 的条件下，研究了不同给压时间对蓝蛤酶解液氨基酸态氮和水解度的影响，见图3. 图3 不同给压时间对蓝蛤酶解液氨基酸态氮和水解度的影响 Fig. 3 The effect of different time on amino acid nitrogenand hydrolysis degree of Aloididae aloidi hydrolysate 由图3可知，氨基酸态氮和水解度在不同给压时间作用下有相同趋势，在50 min 时出现最高值，且差异显著(P≤0.05)。说明在相同压力下，随着给压时间的延长，压力对酶作用越强，当给压时间超过50 min时，压力对酶有抑制现象。故选取 50 min 作为下一步酶解的最适条件。 2.1.4 超高压酶解工艺参数优化正交试验结果及条件验证 2.1.4.1 超高压酶解工艺参数优化正交试验结果 超高压酶解工艺参数优化的正交试验设计及结果见表4。 表4 正交试验设计及结果 Table 4 The orthogonal array design and results 酶添加量 压力 给压时间 氨基酸态氮 水解度 组号 之比 (MPa) (min) (g/dL) (%) 1 3 3 1 0.30 35.46 2 1 2 3 0.39 44.98 3 3 1 3 0.31 35.88 4 1 3 2 0.38 44.46 5 2 3 3 0.37 43.76 6 3 2 2 0.33 38.43 7 2 2 1 0.32 37.98 组号 酶添加量 压力 给压时间 氨基酸态氮 水解度 之比 (MPa) (min) (g/dL) (%) 8 2 2 0.32 37.05 9 0.33 38.43 k 0.37 0.32 0.32 氨基酸态氮 k 0.33 0.35 0.34 ks 0.31 0.35 0.36 K， 42.62 37.12 37.29 水解度 39.59 40.46 39.98 K 36.59 41.23 41.54 氨基酸态氮R 0.05 0.03 0.04 水解度R 6.03 4.11 4.25 由直观分析可知，影响因素的顺序为酶添加量之比>给压时间>压力，最优组合是A CB。超高压酶解最优工艺条件为：酶添加量之比1：1，压力250MPa，给压时间60 min。正交试验的方差分析结果见表5。 表5正交试验方差分析 Table 5 The variance analysis of orthogonal test 变异 自 SS MS F P 来源 由 度 氨基酸 态氮 水解度 氨基酸 态氮 水解度 氨基酸 态氮 水解度 氨基酸 水解度 态氮 酶添加量 之比 2 4.00× 10 54.55 2.00× 103 27.28 32.28 31.11 0.03(0.03 压力 2 2.00× 10-3 28.64 1.00× 103 14.32114.55 16.33 0，06 0.06 给压时间 2 2.00× 10- 27.77 1.00× 10-3 13.88 18.14 15.84 0.05 0.06 误差 0.00 1.75 0.00 0.88 总计 1.0514228.74 由表5可知，压力和给压时间对超高压酶解基本没影响，酶添加量之比对超高压酶解没有显著影响。 2.1.4.2 正交试验结果验证 因最优组在正交表中没有体现，故对正交试验结果进行验证。称取一定量的蓝蛤肉溶液，调节pH 值至7.0，按其重量的0.2%分别添加1：1的风味蛋白酶和复合蛋白酶，在压力250 MPa 下给压60 min 后置于50℃水浴锅中酶解4h，在100℃灭酶10 min，离心(8000×g，20 min)，取上清液备用。测得氨基酸态氮含量为 0.39 g/dL，水解度为45.09%，高于正交试验中所有组分测得的氨基酸态氮值和水解度值，说明试验具有可靠性。故以常压酶解做对照组，以超高压处理做试验组，进行酶解液风味和蓝蛤蛋白结构变化的研究。 2.2 超高压酶解对酶解液风味的影响 2.2.1 感官评价分析 感官评价是人通过自身感觉对产品进行直观描述，量化地反映产品特性。超高压处理组和常压处理组的感官总评分及滋味、气味、色泽分值见表6. 表6 感官评价结果 Table 6 The sensory evaluation results 名称 滋味 色泽 气味 总分 常压 22.60±1.13 17.40±0.84 18.20±0.55 58.20±2.17 UP250 35.20±1.10 21.40±0.76 24.20±1.35 80.80±2.36 由表6可知，经过超高压处理酶解液的滋味、气味、色泽和总评分均高于常压处理组酶解液的感官评分；其中色泽相对差异最小，滋味差异最大，说明超高压酶解对改善风味效果显著。 2.2.2电子鼻分析 根据样品顶空挥发物的数据处理和模式识别151，结果表示为主成分分析(PCA)和LDA。 PCA 是将数据降维并进行线性分类，得到主要的二维散点图16]。常压和 UP250处理酶解液 PCA分析结果图见图4。 图4 不同处理蓝蛤酶解液 PCA 分析结果 Fig. 4 PCA analysis results of Aloididae aloidi enzymatichydrolysate by different treatments 图4中每个椭圆代表常压组和 UP250处理组样液的数据采集点。经分析可知，PC1 和 PC2的贡献率分别为97.91%和1.16%，大于85%，表明 PCA结果分析能代表样品主要的信息特征。经过超高压处理，酶解液 PC1和 PC2都发生了变化。和常压处理组相比，UP250组 PC1变化较大，PC2几乎无变化。说明PCA方法在数据分析中合适，电子鼻可以准确地区分两种酶解液。 LDA是一种常规的模式识别和样品分类方法。LDA主要是利用投影的原理将数据降维，会使组间数据分开，而组内数据聚集。LDA方法注重的是挥发性成分的响应值在空间的分布状态以及彼此之间的距离分析。采用电子鼻分别检测常压与 UP250处理的酶解液 LDA 结果，见图5。 图5 不同处理蓝蛤酶解液LDA分析结果 Fig.5 LDA analysis results of Aloididae aloidi enzymatichydrolysate by different treatments 由图5可知，线性判别函数 LD1 和 LD2的贡献率分别为98.60%和0.18%，区分度没有 PCA的大，但是LDA图可在一定程度上表现出两种酶解液之间气味差异的远近程度。UP250向上出现微小偏移，说明UP250 酶解液中香香成分差异较小，气味较为接近。 2.2.3 电子舌结果分析 电子舌通过模拟人的味觉识别系统，可以在量化感官数据的基础上评价体系的一致性。因而结合感官与电子舌的分析方法，更能真实地反映蓝蛤酶解液的滋味轮廓。超高压处理组与常压处理组的蓝蛤酶解液苦味、鲜味和其回味值见表7. 表7 苦味、鲜味及其回味结果 Table 7 The results of bitterness， umami and aftertaste 名称 苦味 回味 鲜味 丰富度 常压 17.01±0.00 5.08±0.00 12.63±0.00 2.42±0.00 UP250 12.50±0.22 0.90±0.30 13.64±0.04 2.60±0.13 由表7可知，经过超高压处理后，酶解液的苦味及其回味降低，鲜味及其回味增大，结果与感官评价结果一致，进一步证明超高压对改善水产品酶解液的风味有显著效果。 3 结论 通过正交试验确定了超高压酶解最佳工艺：酶添加量之比(复合蛋白酶：风味蛋白酶)3：1、压力250 MPa、给压时间60 min。利用感官评价、电子舌分析得出在压力250 MPa，时间 60 min 条件时其滋味比常压处理的酶解液好；电子鼻分析可以很好地区分两种酶解液18]。超高压酶解可以改善酶解液的滋味，提高鲜味，降低苦腥味。超高压辅助酶解是制备优质海 ( 鲜调味 基 料的一种新 型 技术。 ) ( 参考文献： ) ( [1 ] 周婷婷 ， 郑荣 泉，林志华 ，等 . 光 滑 河蓝蛤 对净化 养殖废水 的 净 化效果[ J].安 徽 农 业 科 学，20 17，45 ( 32)：57 - 60，6 4 . ) ( [2 ]肖 如武. 蓝蛋白 源鲜味 肽 的制备 及 分 离 研究 [ D ] . 广 州 ：华 南 理 工大 学，20 1 0：12-25. ) ( [3 ] 耿瑞 婷 ，王 斌 ， 马 剑 茵 ，等. 扇 贝 蛋 白酶解液脱 腥脱苦 工艺 研 究 [ J ] . 中国调味 品 ，201 4 ， 39( 4)：3 7 -4 3 . ) ( [4 ] K au r B P，Kaus hik N . 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