药物中溶出度检测方案(液相色谱仪)

thermoscientific热线800 8105118电话4006505118www.thermofisher.com Vanquish Core高通量并联分析用于药物溶出度测试 冉良骥吴燕娇金燕赛默飞世尔科技(中国)有限公司色谱质谱部 关键词 Vanquish Core， 双三元，溶出度，一致性评价，溶出曲线，相似因子F2 本文采用赛默飞Vanquish Core双三元高效液相色谱并联系统和深圳锐拓RT621-AT 12杯自动取样溶出度仪，按照仿制药一致性评价体外溶出度的测试要求，建立了溶出度测试的高通量液相分析方法；结合赛默飞变色龙软件自建的溶出度测试报告模板，可根据测试结果自动生成溶出曲线，直接计算相似因子F2值，，t可有效助力制药客户提升仿制药一致性评价的研发效率。 1.前言 自2016年国家药监局明一一致性评价相关指导原则和申报流程以来，经过数年探索和发展，已有多家企业获得了一致性评价批文，截至2020年8月，全国已有600家企业积极参与到一致性评价中，共533个品种、2319个药品获得受理。但随着一致性评价的不断深入，以及相关鼓励政策(如4+7带量采购)的实施，制药企业也面临着愈发激烈的市场竞争。 现阶段仿制药一致性评价中，溶出度研究普遍采用多种溶出条件下，将仿制药与参比制剂进行体外溶出曲线对比，考察两者体外药物溶出速度和程度的相似性。虽然溶出曲线相似，并不意味着两者就生物等效，但充分有效的溶出度研究能显著降低BE失败的风险。为了发现更具区分力的溶出方法，往往需要经过多次试验才能筛选出合适的溶出介质和溶出条件，而如何压缩这个过程带来的时间成本，提高各种口服制剂以及复杂注射剂体外溶出度(或释放度)测试的效率和准确度，为处方研究和工艺确认提供更可靠的数据支持，依然是困扰药企研发部门和CRO公司的巨大挑战。 本文的溶出度测试以水杨酸标准片为测试样品，采用深圳锐拓生产的RT621-AT 12杯自动取样溶出度仪，可自动同步完 成12个样品不同时间点的取样和过滤操作，与常规的6杯或8杯溶出度仪相比，可更好的满足《普通口服固体制剂溶出曲线测定与比较指导原则》中单次试验12个样品量的测试要求；液夜色谱分析过程采用赛默飞Vanquish Core双三元高效液相色谱并联系统，该系统可在一台液相系统上同时开展两种相同或不同的方法测试，结合UHPLC测试方法，可将测试通量提高一倍甚至数倍以上；数据处理过程结合了变色龙软件强大的报告编辑功能，采用自定义的溶出度报告模板，结合测试结果自动生成溶出曲线，直接计算相似因子F2值，减少了繁琐的手动计算，降低了不同软件平台间的数据转录风险。 相比传统的溶出度测试流程，整个试验过程更加简便、高效和准确，且测试结果完全符合测试要求，可有效助力制药行业提升仿制药一致性评价的研发效率。 2.实验方法 2.1仪器 Thermo Fisher Vanquish Core高效液相色谱仪 泵： Vanquish Dual Pump (含两个独立三元梯度泵) 自动进样器： Vanquish Dual sampler FT(含两个独立的自动进样针) ( 温箱： Va n quish Column Compartment检测器：两个独立的Vanquish Diode Array Detector ) ( 2.2软件 ) ( Chromeleon 7.3 ) 甲醇、乙酸(色谱级， Fisher)，磷酸二氢钾、氢氧化钠(色谱级， CNW)，去离子水(18.2MQ@25℃， Millipore纯水机)。 2.4标准品和样品 水杨酸对照品(中国食品药品检定研究院) 水杨酸标准片(300mg/片，非崩解型溶出度标准片，中国食品药品检定研究院) 2.5样品前处理 2.5.1溶出介质制备 取磷酸二氢钾81.6g，加氢氧化钠18.96g，用去离子水稀释至12000ml，即得磷酸盐缓冲液(pH=7.40±0.05)，作为溶出介质待用。 2.5.2对照品溶液 精密称量水杨酸对照品31.7mg，以溶出介质溶解并定容至100mL。 2.5.3溶出度测定(桨法) 取配制好的溶出介质各900ml，分别置于已通过机械性能验证的自动溶出仪的12个溶出杯内，设定溶出温度为37.0±0.5℃，调整浆叶转速为100转/分钟，待溶出温度恒定后，通过自动投药器将12片水杨酸片同时投入12个溶出杯中，并开始同步计时，通过自动取样器先后于投药后5、10、15、30、45、60分钟时取样10 mL，并通过管路终端0.45 um孔径滤膜自动滤过，作为溶出曲线测试的供试品溶液。(取样后自动取液器向各溶出杯自动补充空白溶出介质各10 mL) 取另一批次的水杨酸片，重复上述操作，获得对应的样品溶液，作为参比制剂溶出曲线测试的供试品溶液(用于F2值计算)。 取自动溶出仪于各个时间点吸取的溶出度样品，以VanquishCore并联系统采用以下相同的色谱条件进行测定，其中左泵流路和右泵流路分别测定不同批次的样品溶液。 表1色谱条件 色谱柱 Hypersil Gold， 2.1x50mm， 1.9 pm； P/N： 25002-052130 30℃ 甲醇-2%乙酸(40：60) 0.4mL/min 296nm 2pL 图2 VanquishCore液相系统连接示意图 3.实验结果和讨论 3.1溶出条件的控制 溶出参数的稳定性将直接影响试验结果的准确度和精密度， RT612-AT 12杯自动取样溶出仪采用自动定位取样针、一体成型圆角设计水浴槽，非驻留式温度探头等多项技术，确保溶出温度和转速在整个溶出度测定过程的均一性，并可自动生成完整的溶出参数在线监测报告，方便数据的审计追踪和定期回顾。 图3溶出度仪在线监测报告 3.2液相条件的优化 为尽可能减少液相分析的时间消耗，本试验采用如下尝试，并取得了不错的效果： (1)采用并联系统同时开展供试和参比两组试验数据的测试，由于进样器为独立双针设计，结合双三元泵，实现了一套仪器两条流路独立运行，无交叉污染高效分析，可提高测试通量达100%； 图4 Vanquish 并联系统与常规系统分析时间比较 (2) 采用Hypersil Gold 1.9um超快速色谱柱，待测物主峰在1.3min即可完成分析；同时为降低进样过程带来的时间消耗，通过变色龙软件内置的“准备下一针”脚本命令【SamplerModule.Sampler.PrepareNextInjection】，可在上一针分析结束前，提前吸取下一针样品，从而实现零延迟进样分析。 3.3试验结果的处理 溶出度试验会产生大量的测试数据，常规方法需要计算各个时间点的浓度数据，结合溶出时间，样品杯号等信息进行数据归类，然后按照统计学方法计算各时间点的RSD， 以及溶出曲线相似度的F2值。由于常规色谱分析软件拓展性的限制，客户往往需要将数据转移至Excel文档中进行二次处理，但数据转移过程极易产生不必要的疏漏和偏差，而且也给对应的计算机化系统验证，数据权限管理带来了挑战。 赛默飞变色龙软件系统可通过自定义变量等工具对进样序列中的数据添加合理标识(如溶出杯号，溶出采样时间点等)，结合报告设计器中大量与Excel完全相同的变量工具，用户可以自行设计各种复杂的报告模板，自动完成海量数据(包括但不限于如溶出度试验测试)的完整分析。 下图是由变色龙软件自动生成的本次试验的溶出度测试报告，数据分析与样品测试同步完成，且所有数据完全符合相关测试要求。 注：本试验采用水杨酸测试片，并非正规药物，溶出测试条件参照中国食品药品检定研究院发布的水杨酸片使用说明书，其溶出曲线仅供本次方法验证。 API： Salicylic Acid Dissolution Volume. 900 Rehydration Volumn： 10 Data Location： Demo\Dissolution test Acq.Operator cmadmin Print Time： 2019/12/28Sequence Name： 20191217 Dissolution Test Standard Weight 31.700 Standard Purity. 99.7% Standard Dilution. 100 Time /min Number of cups A-Dissolution(%) ARSD(%) B-Dissolution(%) B RSD(%) Result 0 5 1?12 0 3.8 0 4.61 3.5 04.51 Pass 10 12 7.7 4.64 7.1 4.50 Pass 15 12 11.6 4.33 10.7 4.42 Pass 30 12 22.5 4.73 20.9 4.64 Pass 45 12 32.6 4.15 30.2 4.24 Pass 60 12 41.5 4.15 38.2 4.15 Pass F1 8.10 F2 83.93 Pass 50. o Dissolution-A 45 o Dissolution-B 40 图5变色龙软件自动生成的溶出曲线测试报告 结论 本文采用赛默飞Vanquish Core双三元高效液相色谱并联系统和深圳锐拓RT621-AT 12杯自动取样溶出度仪，按照仿制药一致性评价体外溶出度的测试要求，结合变色龙软件自定义报告模板对水杨酸测试片进行了高通量溶出度测试，方法快速、简便、准确，而且可自自生成溶出曲线，计算F2值，可作为制药行业客户高效开展各类型仿制药一致性评价的参考。 ( 叫中国药典2020版第四部0931通则溶出度和释放度测定 ) ( ② CFDA 2016年106号文《总局关于落实《国务院办公厅关于开展仿制药质量和疗效一致性评价的意见》有关事项的公告》 ) ( I3 CFDA 普通口服固体制剂溶出曲线测定与比较指导原则 ) 本文采用赛默飞Vanquish Core双三元高效液相色谱并联系统和深圳锐拓RT621-AT 12杯自动取样溶出度仪，按照仿制药一致性评价体外溶出度的测试要求，结合变色龙软件自定义报告模板对水杨酸测试片进行了高通量溶出度测试，方法快速、简便、准确，而且可自动生成溶出曲线，计算F2值，可作为制药行业客户高效开展各类型仿制药一致性评价的参考。