为减缓鲜切双孢蘑菇细胞壁的降解,达到延长贮藏期的目的,研究了不同真空度(0,-20,-40,-60,-80,-98 k Pa)下充氮热处理对鲜切双孢蘑菇贮藏中的硬度,细胞壁组分(蛋白质,可溶性糖和几丁质)含量,细胞壁水解酶(β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶)活性的影响。
食品科技FOOD SCIENCE ANDTECHNOLOGY2015年第40卷第11期 适宜真空充氮热处理减缓鲜切双孢参菇细胞壁降解 李顺峰,李静,王安建,田广瑞,张彩凤 (河南省农业科学院农副产品加工研究所,郑州450002) 摘要: 为减缓鲜切双孢蘑菇细胞壁的降解,达到延长贮藏期的目的,,研究了不同真空度(0、-20、、-40、-60、-80、-98kPa)下充氮热处理对鲜切双孢蘑菇贮藏中的硬度、细胞壁组分(蛋白质、可溶性糖和几丁质)含量、细胞壁水解酶(β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶)活性的影响。结果表明,-40 kPa真空充氮热处理可有效减缓贮藏期间鲜切双孢蘑菇硬度的下降和细胞壁可溶性蛋白质与可溶性糖含量的降低及几丁质含量的升高。真空充氮热处理可显著提高贮藏期间鲜切双孢蘑菇β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶活性,但其变化与细胞壁中可溶性糖和几丁质含量呈非对应关系。研究结果表明,适宜的真空充氮热处理可有效减缓鲜切双孢蘑菇硬度的下降和细胞壁组分的降解,是一种有效的物理保鲜技术。 关键词:鲜切双孢蘑菇;真空充氮;;热处理;细胞壁组分;硬度 中图分类号:S646.1*1 文献标志码:A 文章编号::1005-9989(2015)11-0318-07 DOI:10.13684/j.cnki.spkj.2015.11.063 Appropriate filling nitrogen in vacuum combined with heat treatment todelay cell wall degradation of fresh-cut Agaricus bisporus under coldstorage LI Shun-feng, LI Jing, WANG An-jian, TIAN Guang-rui, ZHANG Cai-feng (Institute of Agro-products Processing, Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou450002) Abstract: In order to delay the degradation of cell wall composition to extend the shelf-life of fresh-cutAgaricus bisporus under cold storage, the effects of filling nitrogen in different vacuum (0, -20, -40,-60,-80,-98 kPa) combined with heat treatment on hardness, content of cell wall composition (protein, solublesugar and chitin), and activities of cell wall degradation enzymes (β-1,3-glucanase and chitinase) offresh-cut Agaricus bisporus were evaluated. The results showed that filling nitrogen in vacuum (-40 kPa)combined with heat treatment slowed down the reduce of hardness, the decrease of protein and solublesugar content, and the increase of chitin content in cell wall of fresh-cut Agaricus bisporus. Filling nitrogenin different vacuum combined with heat treatment significantly enhanced β-1,3-glucanase and chitinaseactivities of fresh-cut Agaricus bisporus, but their changes was not correspondence to protein and solublesugar content in cell wall of fresh-cut mushroom. The results indicated that under appropriate condition ( 收稿日期:20 1 5-06- 2 9 ) ( 基金项目:国 家 自 然科 学基 金项目 ( 31 30 1 588);河 南省 农业 科学 院自 主创 新基金 项目( 2 01 3ZZ43)。 ) ( 作者简介: 李 顺 峰 (198 2 一 ) , 男, 博士,助理 研究 员 , 主要从 事农产 品 贮藏与 加工、 天 然活性成分提 取 分离 的研 究 工作 。 ) of filling nitrogen in vacuum combined with heat treatment could effectively postpone the decrease ofhardness and the degradation of cell wall composition of fresh-cut Agaricus bisporus, it is an effectivephysical storage technology. Key words: fresh-cut Agaricus bisporus; filling nitrogen in vacuum; heat treatment; cell wall composition;hardness 双孢蘑菇(Agaricus bisporus)肉质肥厚,营养丰富,富含碳水化合物、蛋白质、氨基酸、维生素、矿物质等,脂肪含量低,其营养价值是水果和蔬菜的4~12倍,素有“植物肉”、、““素中之王”之称。此外,双孢蘑菇还有一定的药用价值,中医认为其味甘性平,有提神、消食、平肝阳等作用,深受国内外市场,尤其是国际市场的青睐。双孢蘑菇不仅是世界上商业化栽培规模最大、普及地区最广、生产量最多的食用菌,也是我国食用菌栽培面积最大、出口创汇最多的种类。目前栽培的双孢蘑菇主要为白色种,其新鲜子实体含水量高,在采后的贮藏运输及加工过程中极易发生变色,导致产品品质下降,甚至丧失食用价值和商品价值。双孢蘑菇采后的货架期由于褐变的原因常常只常短短的几天时间2-3],据统计,双孢蘑菇因褐变造成的损失大约占年产量的15%。鲜切双孢蘑菇由于对蘑菇进行了切割处理,破坏了组织细胞结构,更容易发生褐变,货架期也更短。而细胞壁起着支撑细胞的作用,保持细胞壁结构的完整即可延长其保鲜期。 与植物细胞壁不同,食用菌细胞壁含有较少的木质素和纤维素,却含有较多的多糖和几丁质。食用菌细胞壁主要由葡聚糖、几丁质和蛋白质组成,支链的β-1,3/1,6-葡聚糖位于细胞壁表面,主要连接细胞,而β-1,3-葡聚糖主要起着连接几丁质的作用,几丁质则形成微纤维,主要起着支持细胞壁作用,而蛋白质则镶嵌于葡聚糖和几丁质组成的规则结构中4-7。随着贮藏时间的延长,蛋白质和多糖逐渐被降解而几丁质含量增加,细胞壁结构破坏。 真空充氮热处理先通过抽真空形成低氧环境,降低组织中的含氧量,然后充入氮气以破除真空,同时将热水强行快速渗入双孢蘑菇组织内部,从而去除细胞间隙的气体和抑制酶活,达到抑制褐变、延长保鲜期的目的18-91。根据前期的研究结果,真空充氮热处理可以延缓鲜切双孢蘑菇褐变的发生,但其对细胞壁结构的影响尚未 涉及。鉴于此,本研究以鲜切双孢蘑菇为研究对象,采用自行开发的真空充氮热处理专利设备对鲜切双孢蘑菇进行不同真空度充氮热处理,研究不同真空度下充氮热处理对鲜切双孢蘑菇硬度、细胞壁组分变化和细胞壁酶活性的影响,为其在鲜切双孢蘑菇保鲜上的应用提供理论基础和技术支持。 材料与方法 1.1 材料与试剂 新鲜双孢蘑菇:洛阳奥达特食用菌技术开发有限公司,采收后分层放入贮运保鲜箱预冷20h后立即运回实验室冷藏。选取大小、成熟度一致,颜色洁白、无开伞、无病虫害和机械损伤的双孢蘑菇进行实验。 乙醇、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、N-乙酰氨基葡萄糖、几丁质等:国产分析纯;实验用水:蒸馏水。 1.2 仪器与设备 FA2004C分析天平:上海越平科学仪器有限公司; H2050R台式高速冷冻离心机:湖南湘仪实验室仪器开发有限公司; UV1800紫外可见分光光度计:岛津仪器(苏州)有限公司; SHZ-B水浴恒温振荡器:上海博远实业有限公司医疗设备厂;控制型试管研磨机:德国IKA集团;真空充氮热处理设备:河南省农业科学院自制专利设备,专利申请号201120445515.4; Revco ExF24086V超低温冰箱:美国Thermo公司; LHS-250HC-II恒温恒湿箱:上海一恒科学仪器有限公司;TMS-Pro质构仪:美国FTC公司。 1.3 方法 1.3.1 样品处理 选择个体大小均匀、无病虫害及机械损伤的新鲜双孢蘑菇,去除菇柄,然后将其纵切为厚度5 mm的菇片。取100 g菇片分别在0、-20、-40、-60、-80、-98 kPa下进行脱氧处理,并在达到相应真空度下保持2min, 之后充入氮气使其恢复至常压,然后再重复上述操作2次, 最后在40℃水中处理5 min后取出,冷却沥干表面水分,放入托盘用保鲜膜包裹后在4℃、RH85%的恒温恒湿箱中进行贮藏实验,每个处理重复3次,每2天取样1次,测定质构后将样品用液氮冷冻并用研磨机粉碎后在-80℃冰箱中保存备用。 1.3.2 硬度的测定 随机取10个鲜切双孢蘑菇片进行TPA测试,求其平均值。探头为50 mm圆盘形探头,形形量为30%,测试速度为60 mm/min, 触发力为0.3N,力量感应元为300N。 1.3.3 细胞壁组分的提取与测定 1.3.3.1 细胞壁组分的提取 乙醇不溶物的制备参照Zivanovic等15-61方法,细胞壁各组分的提取参照Zivanovic等15-6与Sietsma和Wessels的方法,并略作修改。称取10 g蘑菇粉冻样,与5倍体积95%乙醇混匀提取5 min, 之后再沸水浴5 min, 降至室温过夜沉淀,用滤纸过滤,残渣用78%乙醇冲洗4次后50℃真空干燥,得乙醇不溶物。取0.20 g乙醇不溶物,加入15 mL煮沸的蒸馏水抽提2h后在10000 r/min离心10 min(4℃), 收集上清液并定容至25 mL, 得水溶性组分;取水不溶性沉淀,用15 mL 1 mol/L NaOH溶液在60℃下提取20 min后在10000 r/min离心10 min(4℃),收集上清液调pH值至7.0,定容至25 mL, 得1mol/L NaOH可溶性组分;取1 mol/L NaOH不溶残渣,用10 mol/L NaOH溶液15 mL煮沸提取1 h,经10000 r/min离心10 min(4 ℃)后将上清液pH值调至7.0,定容至25 mL, 得10 mol/L NaOH可溶性组分;取10 mol/LNaOH不溶残渣与5 mL 6 mol/L HCl溶液混匀后沸水提取4h,旋转离心后收集上清液,10000 r/min离心10 min(4℃), 残渣再用10 mL 1 mol/L NaOH溶液在60℃下提取20 min, 再次离心后将这2部分上清液合并,然后用蒸馏水定容至25mL, 得HCl/1 mol/LNaOH可溶性组分。 1.3.3.2 细胞壁组分的测定 水溶性组分与1 mol/L NaOH可溶性组分中的可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝法测定;水溶性组分、1mol/L NaOH可溶性组分、10 mol/L NaOH可溶性组分和HCl/1mol/L NaOH可溶性组分中的可溶性糖和几丁质含量分别采用苯酚硫酸法2与Ride和Drysdale的方法测定。 1.3.4 β-1,3-葡聚糖酶活性的测定 酶液提取4.称取2.0g双孢蘑菇粉,加入0.1 g PVPP, 在冰浴下与50 mmol/L 醋酸缓冲液(pH5.0)研磨,并定容至10mL,10000 r/min离心30 min(4℃),上清液用于酶·320· 活测定。 β-1,3-葡聚糖酶活性参照Abeles和Forrence方法测定;酶液蛋白质含量采用考马斯亮蓝法测定。 1.3.5 几丁质酶活性的测定 几丁质酶的提取同1.3.4几丁质酶活性的测定参照Boller等5)的方法并略作修改。 总几丁质酶活性的测定:取400pL的胶状几丁质(10 mg/mL)加1400 pL 10 mmol/L磷酸钠缓冲液(pH6.4),混匀,再加1000 pL粗酶液,混匀,置37℃恒温水浴保温2h。随后,置100℃恒温水浴煮沸3 min, 离心10 min(4000 r/min, 室温)。取上清液400 pL, 加20 pL1 mol/L磷酸钠缓冲液(pH7.1)和80 pL的1%(w/v)蜗牛酶,将此反应液置37℃恒温水浴保温30 min, 以水解几丁质寡糖。最后按照Reissig等16方法测定N-乙酰氨基葡萄糖含量。以酶液每秒钟催化产生1 mol N-乙酰氨基葡萄糖为1kat。 几丁质外切酶活性的测定:与上述几丁质酶总活性的测定方法基本相同,只是加入的蜗牛酶已经灭活处理。 几丁质内切酶活性的测定:几丁质酶总活性与相应的外切酶活性之差。 酶液蛋白质含量采用考马斯亮蓝法测定。 1.4 数据处理与统计 所有实验平行3次,实验结果用平均值±SE表示,采用SPSS22.0软件进行ANOVA分析(显著性水平p<0.05),采用Origin 9.2软件作图。 2 结果与讨论 2.1 真空充氮热处理对鲜切双孢蘑菇硬度的影响 图1 不同真空度对鲜切双孢蘑菇硬度的影响 不同真空度充氮热处理对鲜切双孢蘑菇硬度的影响如图1所示。由图1可以看出,在贮藏期内所有处理组鲜切双孢蘑菇硬度均呈逐渐下降 -40、-60 kPa处理组在贮藏4d和10d时硬度分别降低了33.94%、17.60%、18.18%、13.19%和65.71%、62.86%、53.38%、67.23%。综合以上结果, -40 kPa真空充处热处理可以较好的减缓鲜切双孢蘑菇贮藏过程中硬度的下降。 2.2 真空充氮热处理对鲜切双孢蘑菇细胞壁组分变化的影响 图2 不同真空度对鲜切双孢蘑菇细胞壁中蛋白质的影响 不同真空度充氮热处理对鲜切双孢蘑菇细胞壁主要组分——蛋白质、糖和几丁质含量的影响分别见图2、图3和图4。较低真空度(-20 kPa和-40kPa)充氮热处理鲜切双孢蘑菇细胞壁水溶性蛋白质含量呈先下降后上升再下降的趋势,在第4天达到最低值(0.78 mg/g FW和0.86 mg/g FW),之后随着贮藏时间的延长分别在10d和8d达到最高(0.85mg/g FW和0.92 mg/g FW); -60 kPa和-80 kPa真空度下先升高后降低再升高的趋势,并分别在第10天和第8天达到最低值(0.81 mg/g FW和0.80 mg/g 降最小,仅分别降低了22.43%和19.56%,低于对照组的27.25%(图2)。这一结果与Zivanovic等所报道贮藏期间双孢蘑菇对贮藏时间的延长细胞壁蛋白质含量逐渐降低相一致。据报道,蘑菇变软与蛋白质和糖含量的降低及几丁质含量的增加相关。由图2可以看出,各处理组鲜切双孢蘑菇可溶性蛋白质值含量总体呈降低趋势,此结果与图1硬度的下降相一致。 从图3可以看出,各真空充氮热处理组鲜切双孢蘑菇细胞壁水溶性糖含量总体变化不大,-20kPa和-40 kPa处理组水溶性糖含量最低,说明较低的真空充氮热处理不利于保存水溶性糖;除-40kPa真空充氮热处理组1 mol/L NaOH可溶性糖呈先升高后下降趋势外,对照组和其余各真空充氮热处理组可溶性糖含量均呈逐渐降低趋势,这可能是由于-40 kPa处理提高了组织细胞抗性,从而促进了可溶性糖的增加;各处理组10 mol/L NaOH可溶性糖含量呈逐渐降低趋势;6 mol/L HCl-1 mol/LNaOH可溶性糖含量变化与10 mol/L NaOH可溶性糖含量基本呈相反趋势, -20~-60 kPa处理组可溶性糖含量总体保持在较低水平,尤其是-40kPa处理组可溶性糖含量在1.64 mg/g FW波动。以上结果说明,随着贮藏时间的延长,可溶性糖的降解主要是10 mol/L NaOH可溶性糖发生降解。综合图3各可溶性糖含量,各处理组可溶性糖含量总体呈下降趋势,此结果与图1硬度下降相一致,可溶性糖含量的降低可能促进了细胞壁的降解,从而使硬度下降。这一结果与Zivanovic等、Zivanovic等、易琳琳和应铁进所报道的食用菌细胞壁的降解主要是细胞壁糖的分解相一致。 由图4可知,各处理组鲜切双孢蘑菇细胞壁水溶性几丁质、1 mol/L NaOH可溶性几丁质和10 mol/L NaOH可溶性几丁质含量均呈逐渐上升趋势,各真空度处理组随真空度的升高,几丁质含量逐渐升高, -20~-60 kPa处理组几丁质含量低于对照组(0 kPa), -80 kPa和-98 kPa处理组各几丁质含量总体显著(p<0.05)高于对照组;各处理组6mol/L HCl -1 mol/L NaOH可溶性几丁质含量均呈 图3 不同真空度对鲜切双孢蘑菇细胞壁中可溶性糖的影响 55 400- 图4 不同真空度对鲜切双孢蘑菇细胞壁中几丁质的影响 关于食用菌贮藏过程中几丁质含量的增加可导致双孢蘑菇韧性的增加,进而降低其硬度值相一致。 图5 不同真空度对鲜切双孢蘑菇β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶活性的影响 程相关蛋白,β-1,3-葡聚糖酶能以随机作用方式将真菌细胞壁的主要成分——葡聚糖水解,使真菌细胞壁受到损坏,几丁质酶能降解多种真菌细胞壁的主要成分——几丁质。一方面,在正常情况下,β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶在果蔬组织中表达水平很低,而当被微生物侵染、受到机械损伤或采后热处理等,这2种酶活性升高,以增强果蔬对不良外界刺激产生抗性反应7。另一方面,食用菌细胞壁主要由葡聚糖、几丁质和蛋白质组成, β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶可水解细胞壁中的葡聚糖和几丁质,从而使细胞壁降解,硬度下降,不利于其保鲜4-7。真空充氮热处理对鲜切双孢蘑菇β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶活性的影响如图5所示,从图5可以看出,低真空度(-20~-60kPa)充热热处理鲜切双孢蘑菇β-1,3-葡聚糖酶活性呈先升高后下降的趋势,并显著(p<0.05)高于对照组(0 kPa), 高真空度(-80~-98kPa)充氮热处理β-1,3-葡聚糖酶活性与对照相似,呈逐渐升高趋势;各真空充氮热处理组鲜切双孢蘑菇内切几丁质酶、外切几丁质酶和总几丁质酶活性显著高于 对照组,在真空度为-20~-60kPa时,随着真空度的升高,外切几丁质酶或总几丁质酶活性逐渐升高。真空充氮热处理提高了贮藏期间鲜切双孢蘑菇β-1,3-葡聚糖酶活性,从而使细胞壁中的糖含量减少(图3),但各处理组β-1,3-葡聚糖酶活性与可溶性糖的减少并不呈相对应的相关关系。虽然真空充氮热处理提高了鲜切双孢蘑菇中几丁质酶活性,几丁质含量不但未随几丁质酶活性的升高而下降,反而随着几丁质酶活性的升高而升高。真空充氮热处理对鲜切双孢蘑菇β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶活性与可溶性糖和几丁质含量呈非对应关系,这一现象的发生还未见相关的报道,其原因仍需进一步研究。 3 结论 -40 kPa真空充氮热处理可有效减缓贮藏期间鲜切双孢蘑菇硬度的下降。 较低真空度充氮热处理,尤其是-40 kPa处理组,可有效减缓鲜切双孢蘑菇细胞壁可溶性蛋白质和可溶性糖含量的降低及几丁质含量的升高, 有利于保持鲜切双孢蘑菇的硬度。 真空充氮热处理可显著提高贮藏期间鲜切双孢蘑菇β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶活性,但其变化与细胞壁中可溶性糖和几丁质含量呈非对应关系。 适宜的真空充氮热处理可有效减缓鲜切双孢蘑菇硬度的下降和细胞壁组分的降解,是一种有效的物理保鲜技术。 ( 参考文献: ) ( [1] 王丽芳,王晓拓,王志东.贮藏温度对双孢蘑菇褐变和抗 氧化 活性 的 影响 及 动力学研究[ J] . 现 代食品科技,201 5 ,31(2): 157-163 ) ( [2] 2 ( Q in Y, Li u D , W u Y, et al . 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