牛血清白蛋白中二级结构分析检测方案(红外光谱仪)

LAAN-A-FT100 ApplicationnNo.A585Newshttp：//www.shimadzu.com.cn400-650-0439 使用 FTIR 进行蛋白质分析 -用分峰法对牛血清白蛋白进行二级结构分析- 蛋白质是肽键的 C=O 基和 N-H基在聚肽链内或者链间进行氢键结合，形成α-螺旋、β一片层、β一转角、无规卷曲等称为二级结构的局部立体结构。与二级结构相关的红外吸收在多个吸收重叠的状态下，在1650 cm°附近作为一个宽谱峰出现。该谱峰被称为“酰胺Ⅰ带”，是源于肽键C=O 基的伸缩振动，通过解析酰胺Ⅰ带，可以获得关于蛋白质二级结构的信息。 在通过重叠的吸收带求得各吸收带谱峰信息的方法中，有一种方法是曲线拟合(分峰)。分峰是为了尽可能减小用洛伦兹曲线、高斯曲线等的近似曲线表示各吸收带波形的计算光谱与实测光谱间差异，而对各吸收带的近似曲线和谱峰信息(位置、强度、半高宽)进行优化的方法” 在这里我们为您介绍使用分峰进行牛血清白蛋白二级结构解析的分析案例。 S. Iwasaki， R.Fuji |试样的制备 准备市售的牛血清白蛋白，用水(H，O)稀释成2mM。酰胺带与H，O的吸收重叠，所以很多情况下也会使用气(D，O)，在在D，O与HzO中，蛋白质形态和氢键存在差异，因此，使用 H，O更接近自然的状态。 ■牛血清白蛋白的测定 通过在如图1所示的 ATR 测定装置 MicromATRTM，使用九次反射的 ATR 进行测定。使用ATR法时，只需将试样紧贴晶体即可获得光谱，因此，与透射法相比，测定后更容易清洗。另外，在使用九次反射 ATR时，相较于常用的单次反射，灵敏度更高。九次反射 ATR 的使用仅限于液体，在样品量非常少、30 ul以下时也可以分析。测定条件如表1所示。零填充设置为4倍，进行光谱测定。其目的是着眼于酰胺Ⅰ较窄的波数范围，增加傅立叶变换的计算点，获得平滑的光谱。牛血清白蛋白光谱图、HzO红外光谱图、用牛血清白蛋白的红外光谱减去 H，0的红外光谱图得到的差谱(将纵轴强度放大显示)如图2所示。因为酰胺Ⅰ的谱峰与水蒸汽的谱峰重叠，为了去除酰胺Ⅰ谱峰内的 H，O， 使用差谱法，为确保1900~1700 cm-之间的平坦度(图2蓝色箭头)，使用干燥空气对光学系统进行了吹扫。 图1MicromATR 测定装置 表1测定条件 装置 ： IRTracer-100、MicromATR(九次反射 ATR) 分辨率 ：4cm 扫描次数 ：100 切趾函数 ： Sqr-Triangle 零填充 ：4倍 检测器 ： DLATGS 图2牛血清白蛋白和H，O的红外光谱、差谱 二次微分光谱 在进行分峰时，需要提前设置吸收带的峰形、指定峰的个数以及每个峰的位置等的初始值，但在指定峰的个数时，应参考二次微分光谱。在这里，在图3所示二次微分光谱的范围内读取负谱峰的波数，指定峰个数。 图3牛血清白蛋白的二次微分光谱 |波形分离 依据二次微分光谱的信息，在通过图2求得的差谱的1760~1480cm范围内进行了分峰处理。 分峰的条件如表2所示。分峰前的红外光谱、通过分峰而求得的各谱峰、其合成光谱如图4所示。如果分峰精度良好，所测定光谱和分峰的合成光谱就会一致。 峰值曲线的种类 ：洛伦兹函数 基线 ： Offset 1Pt 范围 ：1760~1480 cm' 最大误差 ：0.01% 蛋白质的二级结构分析 对构成酰胺Ⅰ带的1700~1600 cm²附近的波形进行峰值检测，求得谱峰波数和校正面积。其结果如表3所示。参考文献，对各峰进行二级结构分配，求得二级结构的比例。通过上述操作，求得α一螺旋、β一片层、β一转角、无规卷曲的比例分别为23.31%、37.14%、27.56%和12.00%。 表3分峰峰值分析 峰值波数 二级结构 校正面积 面积比 1685.78 B-转角 0.221 2.50% 1679.52 β-转角 0.335 3.80% 1673.25 β-转角 0.48 5.44% 1667.47 β-转角 0.617 6.99% 1662.17 β-转角 0.779 8.83% 1656.87 α-螺旋 0.988 11.19% 1652.05 α-螺旋 1.069 12.11% 1646.75 无规卷曲 1.059 12.00% 1640.96 β-片层 1.078 12.21% 1634.70 β-片层 1.108 12.55% 1626.99 β-片层 1.092 12.37% 总结 对牛血清白蛋白进行分析，通过酰胺Ⅰ带的进行分峰，可以解析水溶液中蛋白质的二级结构。通过采用 FTIR， 可以用少量试样轻松完成解析。 ( 参考文献： ) ( 1)田隅三生编著《红外分光光定法基础与最新方法》株式会社S·T·JAPAN ) ( 2) J i li e KONG， Shaoning YU . Fourier Tran s form Infrared Spectroscopic Anal y sis of Protein Secondary Structures . Acta B ioc h im Biophys Sin 2007 ， 39(8 ) ：549-559 ) ( IRTracer 是岛津制作所株式会社的商标。 ) ( Micro m ATR 是 Czitek， LLC. 的商标。 ) 图4通过波形分离求得的各峰值和合成光谱 岛津企业管理(中国)有限公司岛津(香港)有限公司 ( 免责声明： ) *本资料未经许可不得擅自修改、转载、销售； ( *本资料中的所有信息仅供参考，不予任何保证。 ) 蛋白质是肽键的C=O基和N-H基在聚肽链内或者链间进行氢键结合，形成α－螺旋、β－片层、β－转角、无规卷曲等称为二级结构的局部立体结构。与二级结构相关的红外吸收在多个吸收重叠的状态下，在1650 cm-1附近作为一个宽谱峰出现。该谱峰被称为“酰胺Ⅰ带”，是源于肽键C＝O基的伸缩振动，通过解析酰胺Ⅰ带，可以获得关于蛋白质二级结构的信息。在通过重叠的吸收带求得各吸收带谱峰信息的方法中，有一种方法是曲线拟合（分峰）。分峰是为了尽可能减小用洛伦兹曲线、高斯曲线等的近似曲线表示各吸收带波形的计算光谱与实测光谱间差异，而对各吸收带的近似曲线和谱峰信息（位置、强度、半幅值）进行优化的方法。