婴儿食品中添加剂（香豆素、香草醛、甲基香草醛和乙基香草醛）检测方案(液质联用仪)

UHPLC 结合串联质谱法可靠测定婴儿食品中的添加剂 Meiling Lu 本应用简报介绍了一种灵敏、可靠的方法，用于婴儿食品中四种常用食品添加剂(包括香豆素、香草醛、甲基香草醛和乙基香草醛)的常规监测。本文中所述的LC/MS/MS 方法在 50-5000 pg/kg 的浓度范围内线性良好。各分析物的检测限(LOD)和定量限(LOQ) 分别为 10 pg/kg 和50 pg/kg。婴儿配方奶粉、婴儿谷粉和牛奶在加标浓度为50、100、500 pg/kg 时的回收率范围为 90.7%-98.5%， RSD 低于10%(n=6)。这些结果表明该方法精准可靠，可用于婴儿食品基质中这些添加剂的常规监测。 香豆素和香草醛(包括烷基化香草醛)是两类重要的人工食品添加剂，广泛应用于食品行业中以改善食品的风味特征。然而，这些食品添加剂可能会导致潜在的健康危害，对婴幼儿更是如此。因此，许多国家和地区对这些种类的食品添加剂进行了严格的法规监管11.2。在中国，根据 GB 2760-2016，6个月以下的婴儿食品中不允许使用任何食品添加剂3。因此，需要使用一种灵敏、可靠的方法测定婴儿食品中的这些食品添加剂，以便开展市场上的常规监测，从而确保婴儿食品安 全。本研究介绍一种 SPE 萃取净化结合LC/MS/MS的分析方法，并在三种婴儿食品基质(婴儿配方奶粉、婴儿谷粉和牛奶)中进行验证。 化学品与试剂 选择对香豆素、香草醛、甲基香草醛和乙基香草醛的标准化合物进行监测，并选择使用其同位素标记的类似物进行内标法定量。使用LC/MS 级甲醇和 Milli-Q水配制流动相。甲酸、氨水和乙酸铵为 HPLC级，所有其他试剂均为分析纯。 仪器条件 液相色谱条件 Agilent 1290 Infinity II UHPLC系统 ·1290 InfinityⅡ二元泵，内置脱气机 ·1290 Infinity l自动进样器，具有针座反冲功能 ·1290 Infinity l量容量柱温箱 色谱柱 Agilent ZORBAX Eclipse Plus RRHD C18， 2.1×100 mm，1.8 pm 流动相 A)0.1%甲酸水溶液 B)乙青 流速 0.15 mL/min 柱温 30°℃ 进样量 10.0 pL 后运行时间 3 min 梯度 时间(min) %A %B 0 55 455 40 60 5.01 10 908 10 90 质谱条件 质谱仪 Agilent 6470 QQQ 离子源 安捷伦仑射流 ESI 电离模式 正离子 毛细管电压 4000 V 喷嘴电压 600 V 雾化气(N)压力 50 psi 干燥气(N)温度 300°C 干燥气流速 8 L/min 鞘气(N)温度 350°C 鞘气流速 10L/min 采集模式 MRM 方法 婴儿食品包括婴儿配方奶粉、婴儿谷粉和牛奶，购自当地供应商。按照以下流程图进行样品前处理。 样品前处理过程 结果与讨论 目标分析物在酸性条件下容易质子化；因此，选择在正离子 ESI 电离模式下进行 MRM 扫描检测。然后对分析物及其同位素标记内标 (ILIS)的相应 MRM 采集参数进行了优化，以实现各分析物的高灵敏度和高选择性分析。表1列出了每一化合物的采集参数。将0.1%甲酸/乙腈作为二元流动相，并在优化的梯度洗脱条件下使用 C18色谱柱，可以在7分钟内将四种分析物从色谱柱中洗脱。甲基香草醛和乙基香草醛是一对异构体，无法实现基线分离。但是，每种异构体都具有特定的碎片离子，因此可以对每种分析物进行选择性检测和准确定量。图1显示了分析物和相应 ILIS的典型 MRM 色谱图。 表1.用于高灵敏和高选择性检测的分析物的 MRM参数(*定量离子) 分析物 保留时间(min) 母离子(m/z) 碎裂电压(V) 子离子(m/z) CE(V) D3-香草醛 4.40 156.2 106 93 17 65* 29 香草醛 4.40 153 111 93.2 13 65.2* 29 D5-乙基香草醛 5.35 172 101 112 13 93.1* 21 乙基香草醛 5.35 167.1 111 110.9 13 92.9* 17 D3-甲基香草醛 5.56 170.2 106 142.1* 13 127 21 甲基香草醛 5.56 167.1 123 139* 13 124.1 21 D4-香豆素 6.08 151.1 122 107.1 21 95.1* 29 香豆素 6.08 147 117 103 17 91.1* 30 图1.四种食品添加剂(上图)及其相应内标同位素标记的类似物(IS，下图)的提取 MRM 色谱图 使用三种酸化溶剂对样品萃取进行了研 究。如图2所示，在酸性条件下，乙 腈、乙醚和乙醇三种所选溶剂中，酸化后 的乙腈对各分析物的回收率最高，因此选 其作为萃取溶剂。实验还考察了每种食物 基质的酸含量，并以婴儿谷粉作为示例。如图3所示，加入 40 uL HCI后各分析物呈现出最高回收率。另外，实验还对萃取和净化的其他参数进行了优化，以最大程度提高回收率。优化后的样品萃取和净化程序如方法部分所示。 使用优化的样品前处理方法，对方法性能进行了评估。通过 ILIS 内标校准发现，所有分析物在 50-5000 pg/kg 的范围内具有出色的线性，R²高于0.9995。各基质中每种化合物的 LOD 和 LOQ 分别为10 pg/kg 和 50 pg/kg， 详见表2。 图2.不同溶剂对萃取效率的影响 香草醛 乙基香草醛 甲基香草醛 香豆素 图3.加酸量对萃取效率的影响 表2.方法的线性、LOD 和LOQ 化合物 校准方程 R² 线性范围(pg/L) LOD (pg/kg) LOQ(pg/kg) 香草醛 y=0.009664x-2.789625E-004 0.99978 50-5000 10 50 乙基香草醛 y=0.046100x-5.051333E-004 0.99962 50-5000 10 50 甲基香草醛 y=0.037052x-4.161242E-004 0.99966 50-5000 10 50 香豆素 y=0.050603x-8.280931E-005 0.99962 50-5000 10 50 通过分析加标浓度分别为1倍、2倍和5倍 LOQ浓度的三种基质样品，各浓度重复测定6次，评估方法的回收率和精密度。如图4所示，所有基质的回收率范围为81.7%-102%， RSD% 低于 10%，表明该方法准确可靠。 本研究展示了一种用于测定婴儿配方奶粉、婴儿谷粉和牛奶中四种常见添加剂的可靠 UHPLC-MS/MS 方法。该方法具有出色的线性、准确度和精密度，能够可靠用于婴儿食品中这些添加剂的常规监测。 1. US Food and Drug Administration.21 CFR 189.130-Coumarin. 2002 2. The European Parliament andthe Council. Regulation(EC)No. 1334/2008 3. 中国 GB 2760-2016食品安全国家标准食品添加剂使用标准 香草醛 乙基香草醛 甲基香草醛 香豆素 图4.在三种基质三个水平下的加标回收率和精密度(n=6)。A)婴幼儿配方奶粉；B)婴儿谷粉； C)牛奶 查找当地的安捷伦客户中心：www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 本应用介绍了一种灵敏、可靠的方法，用于婴儿食品中四种常用食品添加剂（包括香豆素、香草醛、甲基香草醛和乙基香草醛）的常规监测。本文中所述的LC/MS/MS 方法在 50–5000 μg/kg 的浓度范围内线性良好。各分析物的检测限(LOD) 和定量限(LOQ) 分别为 10 μg/kg 和 50 μg/kg。婴儿配方奶粉、婴儿谷粉和牛奶在加标浓度为 50、100、500 μg/kg 时的回收率范围为 90.7%–98.5%，RSD 低于10% (n = 6)。这些结果表明该方法精准可靠，可用于婴儿食品基质中这些添加剂的常规监测。