婴儿奶粉及大豆产品中三聚氰胺及其类似物检测方案(二手分析仪器)

Stephan Baumann Agilent Technologies， Inc.5301 Stevens Creek BlvdSanta Clara CA 95051 采用三重串串四极杆 GC/MS的联用和反吹技术快速筛选和确认婴儿奶粉及大豆产品中的三聚氰胺及其类似物 应用食品 摘要 通过利用安捷伦7890A/7000A 系列带 Ultimate Union 吹扫的三重串联四极杆 GC/MS联用和反吹技术，开发了一种快速筛选和确认婴儿奶粉和豆制品中的三聚氰胺、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺和氰尿酸的方法。该方法中的提取及衍生过程与 FDA(美国食品和药物管理局)的GC/MS 方法相同。在 0.16到2.5 ppm 的浓度范围内可获得卓越的线性度(R2>0.99)，且运行时间不到15分钟。 由于在美国生产的奶粉、分布于加拿大市场的巧克力、在荷兰销售的饼干、在泰国销售的炼乳以及在香港销售的鸡蛋中均检测到了三聚氰胺，在食品中搀杂三聚氰胺已迅速成为一个国际问题。对此，许多国家已经建立了针对三聚氰胺的许可浓度限制，如FDA要求婴儿奶粉中三聚氰胺的最高残留限量 (MRL) 为百万分之一(1 ppm)， 其他产品则为 2.5 ppm。 FDA的 GC-MS 筛选法[1]能够检测的三聚氰胺及其类似物(三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺和氰尿酸)的灵敏度为2.5 ppm。然而，FDA在2009年2月的进口警报要求所采用的测试方法对于三聚氰胺及其类似物的检测灵敏度必须达到 0.25 ppm， 以保证检测结果符合MRL 规定。因此，在新的规定下， FDA的 GC-MS 筛选法已不能适用于筛选三聚氰胺及其类似物，其确认也需要通过额外的正交法进行。 本应用中说明的方法对 FDA 的 GC-MS 筛选法进行了改进，采用了新型 Agilent 7000A 系列三重串联四极杆 GC/ MS联用技术。改进后的新方法不改变样品的提取和衍生程序，通过使用带吹扫接头的气相色谱柱和反吹技术，使得运行时间在15分钟以内。该方法可以使三聚氰胺及其类似物的检测精度达到 0.25 ppm， 其定量也具有高度的重现性和准确性。最重要的是，这种方法经一次短时间运行就能实现三聚氰胺及其类似物的筛选、定量和确认。 实验 标样和试剂 所使用的标样和试剂列于表1中。三聚氰胺、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺和氰尿酸分别制成 DEA/H20 (体积比为20/80)混合溶剂的溶液，浓度均为1000 pg/mL， 储存温度为4℃。内标物(2，6-二氨基-4-氯嘧啶， DAPC) 配制成浓度为57.7 ng/mL的吡啶溶液，该溶液用于制备 FDA 方法[1]中的基质匹配标准物。基质样品由 FDA 无偿提供。 表1. 标样与试剂 标样 三聚氰胺 Sigma-Aldrich >99%纯度 氰尿酸 TCI-America >98.0% 溶剂 三聚氰酸一酰胺 TCI-America >98.0% 三聚氰酸二酰胺 TCI-America >95.0% 内标 Sigma-Aldrich 98% 二乙胺 Sigma-Aldrich Sigma 超纯级 (DEA) 吡啶 Fisher 认证的 A.C.S. Scientific 试剂 乙腈 Fisher 高效液相色谱级 甲基硅烷化试剂 BSTFA 含 Sigma-Aldrich 衍生化级 1%TMCS' (SYLON BFT) *BSTFA：双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺， TMCS：三甲基氯硅烷 仪器 实验所采用的仪器包括配置分流/不分流毛细管进样口的安捷伦7890A气相色谱仪、配置三重离轴检测器的安捷伦7000A系列三重串联四极杆 GC /MS联用仪以及安捷伦7683B 全自动液体进样器(ALS)。分流/不分流进样口装有一个长寿命隔垫(部件号5183-4761)和一个去活的分流单锥形注射衬管(部件号5181-3316)。用10 pL注射器(部件号9301-0714)注射。各仪器使用条件列于表2。 表2.气相色谱仪和质谱仪条件 气相色谱运行条件 色谱柱 两根15mx0.25 mm x0.25 um HP-5ms 色谱柱 (p/n 19091S-431) 进样温度 280°C 进样压力 12.9 psi 载气 氦气，恒流模式， 1.2 mL/min 脉冲不分流 25 psi at 0.5 min 柱箱升温程序 100°℃(保持1 min)， 以10°℃/min 升至210°C 柱流速 41 cm/s 注射体积 1pL 传输线温度 290°C 气相色谱后运行条件 反吹装置 由压力控制模块(部件号G3476-60501)控制的吹扫 Ultimate Union(部件号 G3186-60580) 反吹装置条件 -3.6 mL/min， 于300°℃保持1.3 min 质谱运行条件 调谐方式 自动调谐 Delta 电子倍增器电压 400 V 采集参数 El；选择性反应监测 溶剂延迟 6分钟 质谱温度 离子源温度230°C；四极杆温度150℃ 样品制备 称取0.5g样品于50mL聚丙烯离心管中。用 DEA /水/乙腈按体积比 10：40：50配制提取溶剂，并取 20mL 加入到称量好的样品中。其中， DEA 能够分离三聚氰胺-氰尿酸混合物，从而降低了假阴性检测的风险。 DEA 还提高了三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸二酰胺的溶解度，而在传统的提取溶剂中，它们的溶解度是极低的。将样品密封好，进行涡旋混合后经超声波处理30分钟。然后以5000 转/min 或更高的速度下离心分离样品10钟钟后，将上层清液通过 0.45 um 孔径尼龙过滤器过滤。 衍生处理 取160pL滤液到一个 GC 玻璃样品瓶中，在70℃的氮吹蒸发干燥，加入 600 pL 的 ISTD 和200pL含1%TMCS的BSTFA。样品在注入前，经涡旋混合，并在70°℃下恒恒45分钟。 分析参数 三聚氰胺及其类似物以及内标的相关分析参数列于表3中。 表3.分析参数 三重串联四极杆气相色谱/质谱联用 驻留时间 碰撞能量 化合物 RT SRM (ms) (EV) 三聚氰胺 12.467 327→171 20 17 342→285 150 20 342→213 150 22 三聚氰酸一酰胺 10.801 344→171 50 22 344→214 50 15 329→171 50 20 三聚氰酸二酰胺 11.748 328→171 50 25 343→214 50 20 343→171 50 30 氰尿酸 9.613 345→215 50 8 345→188 50 12 330→215 50 4 DACP (ISTD) 11.185 273→237 150 12 2，6-Diamino-4- 273→99 150 20 结果与讨论 带UItimate Union 吹扫系统的反吹技术 反吹技术可以从色谱柱中除去高沸点物质，通过将后流出的组分从进样口的分流放空口中反吹出去，而使高沸点组分不经过整个色谱柱，也不进入MSD。反吹可以降低化学噪音和分析周期时间，从而提高检测效率。由于减少色谱柱和质谱检测器的维护时间，系统的正常运行时间也有所增加。安捷伦微板流路控制技术模块包括一个专有的解决方案，能够快速简便地实现反吹，死体积小，从而提高分离度。该模块还包含垫圈和接头以消除漏气。所有微板流路控制技术模块都需要使用辅助电子气动控制(EPC) 模块或气动控制模块(PCM)来提供精确控制的第二气源，以引导色谱柱气流能流向正确的色谱柱或检测器。在正常操作时， PCM的压力等于或略高于通过色谱柱的载气压力。在反吹过程中，进口压力下降到 1 psi， 而 PCM压力增加，从而驱使色谱柱气流反向流经色谱柱，并吹扫出进样口。 一个替代反吹的独特方法是在分析柱的中部使用微板流路控制技术装置。此时，采用两个15米色谱柱替代30米色谱柱，两个色谱柱由超低死体积吹扫 Ultimate Union连接(如图1所示)，PCM则只提供足够的补充气与从第一个色谱柱中的气体流量相匹配。由于只有最优的载气流量进入质谱仪，因此需要增加的气流很小，不会发生灵敏度降低。该配置的反吹过程，是通过降低第一个色谱柱的流量和压力，增加第二个色谱柱的流量和压力来完成的。 图2给出了具有吹扫终端配置的反吹的例子。图中上端的图谱显示了六个标样，其中第三个峰被认为是最后一个感兴趣的峰，第四个峰是第一个高沸点组分干扰物。中图显示了(a)相同标样在10.1分钟开始反吹，其中流量在第一个15米色谱柱中下降，(b) 在第二个色谱柱上升。a和b点之间的时间是最后要分析的组分在第二个色谱柱中的停留时间。最后的组分被保留，但后洗脱物不会进入到质谱检测器中。下图说明在接下来的空白运行中没有交叉污染。或者，可以在最后一个感兴趣的峰被流出(b点)后开始反吹。这就避免了需要通过实验来确定最后流出的目标化合物在第二色谱柱中的停留时间，从而缩短运行时间周期。 图1. 带 Ultimate Union 吹扫的GC/MS配置示意图 图2.带Ultimate Union 吹扫反吹示意图。上图：没有进行反吹。中图：10.1 min 开始反吹 (a)直到第三个组分从第二色谱柱中洗脱(b)。下图：空白进样显示没有交叉污染 三聚氰胺及其类似物的分析 基于三重串联四极杆GC/MS联用系统，我们开发了一种一次运行就能出色的分离和分析三聚氰胺、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺和氰尿酸的新方法，且运行时间不到15分钟(图3)。新的三重串串四极杆 GC/MS 法显著提高了检测灵敏度和选择性， 图4给出了其与 GC/MS 选择离子检测(SIM) 的对比。新方法能够在 0.25 ppm 灵敏度下对三聚氰胺进行非常干净地定量 MRM分析，而不管采用何种 SIM 离子， GC/MS SIM 法都难以在2.5 ppm 灵敏度下有效地减少化学噪音。 图3.由SRM分析得到的重构总离子流色谱(RTICC)，表明对三聚氰胺及其类似物的分辨率 图4. 分别采用三重串联四极杆GC/MS(a)和 GC/MS SIM 法检测豆粉中 0.25 ppm三聚氰胺的结果对比。采用三重串联四极杆 GC/MS 法的定量离子通道为m/z327.1→171.1，而定性离子通道为 m/z342.1→295.1(定量离子峰面积的2.5%)和m/z342.1→217.1(峰面积的4.8%)。不确定性范围也列于(a)中。 GC/MS法中使用的 SIM离子则为m/z342.2、327.2和171.1 (b) 灵敏度与定量 在基质(包括婴儿奶粉和豆粉)中分别加入三聚氰胺及其三种类似物的标准品，浓度分别为0.78、1.25、3.9和12.5 ng/mL，对应于0.16到2.5ppm 的检测水平。并针对每种基质中的四种化合 图5. 在婴儿奶粉中的三聚氰胺及其衍生物的定量校准曲线线性拟合 表4. 婴儿奶粉中的三聚氰胺及其衍生物基于基质匹配标样的定量校准数据 标样浓度 测试物浓度 定量准确度 (ng/mL) (ng/mL) (%) 三聚氰胺 0.78 0.79 101.3 1.25 1.23 99.1 3.90 4.39 112.5 12.5 12.50 100.0 聚氰酸一酰胺 0.78 0.86 110.3 1.25 1.25 99.9 3.90 3.79 97.2 12.5 12.52 100.2 三聚氰酸二酰胺 0.78 0.90 115.5 1.25 1.22 97.2 3.90 3.78 97.0 12.5 12.52 100.3 氰尿酸 0.78 0.67 86.1 1.25 1.40 111.9 3.90 3.85 98.8 12.5 12.51 100.1 表5.豆粉中基于基质匹配标样的三聚氰胺及其衍生物定量校准数据 标样浓度 测试物浓度 定量准确度 (ng/mL) (ng/mL) (%) 三聚氰胺 0.78 0.76 97.7 1.25 1.20 96.3 3.90 3.98 102.2 12.5 12.48 99.8 三聚氰酸一酰胺 0.78 0.72 92.9 1.25 1.18 94.2 3.90 4.07 104.4 12.5 12.46 99.7 三聚氰酸二酰胺 0.78 0.81 103.7 1.25 1.22 97.9 3.90 3.90 99.9 12.5 12.50 100.0 氰尿酸 0.78 0.71 91.3 1.25 1.22 94.5 3.90 4.49 115.1 12.5 12.01 96.1 确认 为了确定一套可广泛接受的程序来对限定物质进行科学确认，欧盟科学家开发了“识别点”系统。分析方法提供的识别点越多，越能肯定所确认的化合物的存在。确定化合物的 MRL 要求有三个识别点。当由于化合物的毒性而无法界定其 MRL时，则该化合物在所有级别上都是被禁止的。这些化合物要求有四个识别点。当 GC/MS需要监测四个离子以提供四个识别点时，使用三重串联四味杆的GC/MS/MS联用仪则只需监测两个选择反应监测(SRM)通道。利用三重串联四极杆 GC/MS系统分析三聚氰胺及其类似物需要利用至少两个 SRM 通道， 可以在单次运行中获得有效筛选和完全确认。 图7和图8显示了婴儿奶粉和豆粉中的四种化合物 GC分离的定量和定性离子通道的色谱图。每一种情况定性离子都对定量离子进行了归一化处理，以便从两个离子的轮廓图中能更好的显示出一致的峰形。因此，这些离子轮廓图为每个样品基质中的四种化合物都给出了完全的确认。 结论 为了在一次短时间运行中就实现对三聚氰胺、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺和氰尿酸的筛选、定量和确认，通过应用安捷伦科技公司的三重串联四极杆 GC/MS联用系统，对 FDA的GC/MS 筛选方法进行了改进。该方法不改变原有的提取或衍生程序，且其运行周期时间仅约为15分钟。此外，该方法符合新的FDA测试要求，即测试灵敏度应达到 0.25 ppm， 并且在2.5 ppm的浓度范围内表现出了了异的定量线性，定量精度达到97%以上。为了对阳性确认提供有效的识别点，分别给出了四种化合物的两个 SRM 通道。 图7.安捷伦三重串联四极杆GC/MS联用系统能在一次运行中实现确认和筛选：婴儿奶粉中浓度为0.78 ng/mL的三聚氰胺及其类似物的定量离子和归一化定性离子 图8.豆粉中浓度为 0.78 ng/mL的三聚氰胺及其类似物的定量离子和归一化的定性离子 致谢 感谢 Greg Mercer、西北太平洋地区实验室以及食品和药物管理局的指导和在材料方面的援助。 ( 参考文献 ) 1.U.S. Food and Drug Administration， “GC-MS Screen forthe Presence of Melamine， Ammeline，Ammelide， andCyanuric Acid，" LIB No. 4423， Volume 4， October 2008. 2. H. Prest， C. Foucault and Y.Aubut， "Capillary FlowTechnology for GC/MS：Efficacy of the Simple TeeConfiguration for Robust Analysis Using RapidBackflushing for Matrix Elimination，"AgilentTechnologies publication 5989-9359EN. 3. H. Prest， Capillary Flow Technology for GC/MS： "A SimpleTee Configuration for Analysis at Trace Concentrationswith Rapid Backflushing for Matrix Elimination，"AgilentTechnologies publication 5989-8664EN. 了解更多信息 有关我们产品和服务的更多信息，请访问www.agilent.com/chem/cn。 www.agilent.com/chem/cn 安捷伦对本资料中出现的错误，以及由于提供或使用本资料所造成的相关损失不承担责任。 本资料中涉及的信息、说明和规格，如有变更，恕不另行通知。 ◎安捷伦科技公司，2009 中国印刷 2009年5月22日 5990-4071CHCN · Agilent Technologies 通过利用安捷伦7890A/7000A系列带UltimateUnion吹扫的三重串联四极杆GC/MS联用和反吹技术，开发了一种快速筛选和确认婴儿奶粉和豆制品中的三聚氰胺、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺和氰尿酸的方法。该方法中的提取及衍生过程与FDA（美国食品和药物管理局）的GC/MS方法相同。在0.16到2.5ppm的浓度范围内可获得卓越的线性度（R2>0.99），且运行时间不到15分钟。